Инфракрасный спектр биологического образца представляет собой суммарный спектр, в котором происходит наложение полос поглощения различных функциональных групп органических веществ а также воды. Это явление усложняется в виду взаимодействия отдельных видов колебаний указанных групп, при этом происходит искажение формы полос поглощения и смещение их максимумов. Поэтому на инфракрасных спектрах наблюдается большое число широких полос поглощения с неясными максимумами. Обычно расшифровка инфракрасных спектров биологических образцов весьма затруднительна, поэтому, чтобы облегчить расшифровку суммарного спектра, необходимо разделять биологический образец на более простые компоненты. Это дает возможность получить большее число полос поглощения для исследуемого вещества и более точно определить состав компонентов в образце.
Положительной особенностью метода инфракрасной спектроскопии является то, что полосы поглощения одного и того же вида колебаний атомной группы различных веществ располагаются в определенном диапазоне инфракрасного спектра (например, 3720-3550 см-1- диапазон валентных колебаний групп -ОН; 3050-2850 см-1 - групп -СН, -СН2, -СН3 органических веществ). Точное положение максимума полосы поглощения атомной группы в пределах этого диапазона указывает на природу вещества (так, максимум 3710 см-1 свидетельствует о наличии групп -ОН, а максимум 3030 см-1 - о присутствии групп =С-Н ароматических структур).
Характеристические частоты функциональных
групп в органических соединениях
Однако, если исследуемый объект представляет собой не механические смеси, а является сложным химическим соединением, то указанные особенности инфракрасных спектров не обнаруживаются.
Число характеристических полос поглощения атомных групп, их интенсивность и положение максимумов, наблюдаемых на инфракрасных спектрах, дают представление о строении индивидуального соединения или о компонентном составе сложных веществ. Интенсивность полосы поглощения определяется величиной, численно равной энергии, которую поглощают атомные или функциональные группы образца при прохождении через них инфракрасных лучей. Важным диагностическим показателем полос поглощения является величина пропускания. Данный показатель и концентрация вещества в снимаемом объекте связаны обратной пропорциональной зависимостью, что используется для количественных определений содержания отдельных компонентов.
Метод инфракрасной спектроскопии позволяет исследовать твердую, жидкую фазы биологической массы. Этот метод позволяет изучать образец в целом, без его расчленения и предварительных химических обработок, а также использовать малые (до 10 мг) навески.
Поглощение органических веществ в различных участках инфракрасного диапазона определяется входящими в состав молекулы химическими группировками, а точнее образующими их связями, поэтому метод позволяет суммарно определить родственные вещества, по характеристическим зонам поглощения.
Инфракрасная спектроскопия широко применяется для анализа биологических жидкостей, в частности крови и ее фрагментов, а в последнее время для диагностики и прогнозирования различных заболеваний все в возрастающей степени используется ротовая жидкость или смешанная слюна, однако интерпретация полученных результатов осложняется в связи с многокомпонентностью объектов исследования.
При инфракрасной спектроскопии крови и слюны возможен количественный анализ только функциональных групп, входящих в основные компоненты в аналитических количествах. Поэтому анализ образцов данных жидкостей вызывает затруднения, т.к. по существу анализируется их водная основа
В медицине инфракрасной спектроскопии в последние годы используют для определения некоторых веществ в биологических жидкостях: крови, моче, слюне, слезной жидкости, желчи, молоке, для идентификации некоторых витаминов, гормонов и других биологически активных веществ.
Кроме того, в последнее время метод находит все более широкое применение для характеристики конформационных и структурных изменений белков, липидов, фосфолипидов биомембран клеток, исследуемых в биоптатах, а также с помощью волоконно-оптических методик.
С помощью этого метода можно оценивать фармокинетику различных лекарственных препаратов. При сахарном диабете выявлены достоверно значимые изменения инфракрасного спектра крови Доказана возможность использования показателей инфракрасного спектра для ранней диагностики стоматологических заболеваний и прогнозирования кариеса зубов у детей. Проведено исследование быстрых изменений показателей инфракрасного спектра крови для прогнозирования, диагностики и определения степени тяжести остеопороза и эффективности его лечения. Доказана возможность использования инфракрасной спектроскопии для изучения процессов регенерации.
Инфракрасная спектроскопия применяется также и в судебном анализе для изучения митохондриального генома при идентификации личности и определении отцовства, т.к. идентифицируется генетический фокус DIS80, содержащий переменные числа тандемных дупликаций.
Приборы для инфракрасной спектроскопии
Для регистрации спектров используют классические спектрофотометры и фурье-спектрометры.
Исследовательский ИК спектрометр Varian Scimitar 1000 FT-IR
Основные части классического спектрофотометра - источник непрерывного теплового излучения, монохроматор, неселективный приемник излучения. Кювета с веществом (в любом агрегатном состоянии) помещается перед входной (иногда за выходной) щелью. В качестве диспергирующего устройства монохроматора применяют призмы из различных материалов (LiF, NaCl, KCl, CsF и др.) и дифракционной решетки. Последовательное выведение излучения различных длин волн на выходную щель и приемник излучения осуществляется сканирование поворотом призмы или решетки. Источники излучения - накаливаемые электрическим током стержни из различных материалов. Приемники: чувствительные термопары, металлические и полупроводниковые термосопротивления (болометры) и газовые термопреобразователи, нагрев стенки сосуда которых приводит к нагреву газа и изменению его давления, которое фиксируется. Выходной сигнал имеет вид обычной спектральной кривой.
Достоинства приборов классической схемы: простота конструкции, относительная дешевизна. Недостатки: невозможность регистрации слабых сигналов из-за малого отношения сигнал: шум, что сильно затрудняет работу в далекой инфракрасной области; сравнительно невысокая разрешающая способность (до 0,1 см-1), длительная (в течение нескольких минут) регистрация спектров.
В фурье-спектрометрах отсутствуют входная и выходная щели, а основной элемент - интерферометр. Поток излучения от источника делится на два луча, которые проходят через образец и интерферируют. Разность хода лучей варьируется подвижным зеркалом, отражающим один из пучков.
Блок-схема фурье-спектрометра:
1 – источник излучения; 2 – прерыватель; 3 – светоделитель; 4 – подвижное зеркало;
5 – неподвижное зеркало; 6 – система линз; 7 – кюветное отделение;
8 – детектор; 9 – аналого-цифровой преобразователь; 10 – контроллер;
11 – компьютер; 12 – цифровая печать; 13 – дисковая память.
Первоначальный сигнал зависит от энергии источника излучения и от поглощения образца и имеет вид суммы большого числа гармонических составляющих. Для получения спектра в обычной форме производится соответствующее фурье-преобразование с помощью встроенной ЭВМ.
Наиболее эффективное использование оборудования для инфракрасной Фурье спектроскопии возможно только при соответствующей подготовке пробы, предназначенной для анализа. При работе на инфракрасных Фурье спектрометрах можно использовать как традиционные способы пробоподготовки для инфракрасной спектроскопии, так и некоторые новые приемы, которые обусловлены прежде всего меньшим количеством вещества, достаточным для анализа и возможностью использования дополнительных устройств (приставок).
Достоинства фурье-спектрометра: высокое отношение сигнал: шум, возможность работы в широком диапазоне длин волн без смены диспергирующего элемента, быстрая (за секунды и доли секунд) регистрация спектра, высокая разрешающая способность (до 0,001 см-1). Недостатки: сложность изготовления и высокая стоимость.
Все спектрофотометры снабжаются ЭВМ, которые производят первичную обработку спектров: накопление сигналов, отделение их от шумов, вычитание фона и спектра сравнения (спектра растворителя), изменение масштаба записи, вычисление экспериментальных спектральных параметров, сравнение спектров с заданными, дифференцирование спектров и др. Кюветы для инфракрасных спектрофотометров изготовляют из прозрачных в инфракрасной области материалов. В качестве растворителей используют обычно ССl4, СНСl3, тетрахлорэтилен, вазелиновое масло. Твердые образцы часто измельчают, смешивают с порошком КВr и прессуют таблетки. Для работы с агрессивными жидкостями и газами применяют спец. защитные напыления (Ge, Si) на окна кювет. Мешающее влияние воздуха устраняют вакуумированием прибора или продувкой его азотом.
Для случая слабо поглощающих веществ (разреженные газы и др.) применяют многоходовые кюветы, в которых длина оптического пути достигает сотен метров благодаря многократным отражениям от системы параллельных зеркал. Большое распространение получил метод матричной изоляции, при котором исследуемый газ смешивают с аргоном, а затем смесь замораживают. В результате полуширина полос поглощения резко уменьшается, и спектр получается более контрастным. Применение специальной микроскопической техники позволяет работать с объектами очень малых размеров (доли мм).
Подготовку твердых образцов для регистрации их инфракрасных спектров осуществляют двумя способами:
1. Суспензионный метод представляет собой растирание образца до мелкодисперсного состояния (размер частиц 2-7 мкм) и приготовление суспензии в иммерсионной жидкости с близким к образцу показателем преломления. При этом в качестве матрицы обычно используют вазелиновое масло, фторированные или хлорированные масла. Полученная полупрозрачная паста наносится с помощью шпателя на окно из оптического материала в виде тонкой равномерной пленки.
Наиболее часто в экспертной практике в качестве иммерсионной жидкости используется вазелиновое масло. Однако, спектр вазелинового масла имеет полосы поглощения в областях 2900, 1460, 1380 и 725 см-1. Эти полосы накладываются на полосы поглощения образца, компенсировать их можно либо с помощью кюветы сравнения, либо путем вычитания спектра вазелинового масла из суммарного спектра. На практике перфторуглеводородное масло используют при исследовании веществ в области 4000-1500 см-1 (не поглощает фторированное масло), а вазелиновое масло – для исследования в области 1500-400 см-1 (мало поглощает вазелиновое масло).
