К сожалению, радиоактивные изотопы кислорода и азота имеют совершенно неприемлемый для работы в life science период полураспада — от нескольких минут до миллисекунд. Такие ультра короткоживущие изотопы (УКЖ) уже применяются в медицине и технике, однако их использование в физико-химической биологии весьма проблематично.
Перечень радионуклидов, которые могут использоваться (и используются) для получения модифицированных молекул, может быть существенно расширен. Такие модифицированные молекулы часто используются не только в life science, но и в медицине (как для диагностики, так и для терапии). Весьма популярны для медико-биологических работ радионуклиды технеция, хрома и других. В этом материале не будут рассматриваться медицинские аспекты применения меченых соединений, поэтому сосредоточимся на использовании радионуклидов, приведенных в таблице 1.
Следует заметить, что все радионуклиды из таблицы 1 являются β-излучателями, кроме 125I, который "затесался" в этот список скорее в знак "особых заслуг", о которых ниже будет отдельная глава. На самом деле 125I для меченых соединений практически не используется, так как в живых организмах особого разнообразия молекул, содержащих йод, не наблюдается.
Вообще, "идеальный радионуклид" для life science должен отвечать следующим критериям:
25. Элемент должен входить в состав всех органических молекул. Это понятно, так как делает возможным введение "меченого атома" в любую молекулу.
26. Период полураспада "идеального радионуклида" 10÷100 дней. Это будет соответствовать теоретической молярной активности в диапазоне 1018÷1017 Бк/моль и сможет обеспечить высокую чувствительность метода.
27. Чистый β-излучатель с максимальной энергией излучения не более 0,4 Мэв.Это позволяет сравнительно просто детектировать радионуклид и в тоже время сохраняет высокое разрешение методов, связанных с авторадиографической детекцией меченых продуктов.
К сожалению, ни один из приведенных в таблице радионуклидов не соответствует "идеалу". Тритий и углерод имеют слишком большой период полураспада, т.е. низкую молярную активность (особенно, углерод), а очень низкая энергия излучения трития сильно осложняет его детекцию и радиометрию. Весьма удобные ядерно-физические характеристики радиоактивных изотопов фосфора и серы не могут компенсировать ограниченность распространения этих элементов в органических молекулах. Поэтому выбор радионуклида, который предполагается использовать для исследования, приходится делать с учетом разных факторов, которые подробно разбираются ниже.
Все приведенные в таблице радионуклиды — искусственные, реакторные изотопы. В природе существуют радиоактивные изотопы 3H и 14C, но их содержание очень низкое, и препаративное выделение таких изотопов как сырья для синтеза меченых соединений является задачей с экономической точки зрения абсолютно разорительной. Кратко способы получения радионуклидов из таблицы 1 будут сообщены в соответствующих разделах.
5. Технические характеристики меченых соединений
Все препараты меченых соединений, которые используются в life science, имеют технические характеристики, подробно указанные фирмой-производителем в паспорте (сертификате) и кратко — на флаконе с препаратом. Ниже подробно разбираются термины технических характеристик и их значение.
5.1. Радионуклидная чистота [ % ]
Это характеристика радиоизотопной чистоты препарата. Для большинства радионуклидов, применяемых в life science, не очень важна. Примеси других радионуклидов в тритиевых или 35S соединениях отсутствуют. Однако, для соединений, меченных фосфором-33, это важнейшая характеристика, т.к. часто наличие примеси фосфора-32 более 2÷3% делает препарат фосфора-33 весьма сомнительным по качеству с точки зрения многих методик.
Иногда фирмы-производители искусственно "подогревают" интерес биохимиков к препаратам с очень высокой радионуклидной чистотой. Например, у йода много радиоактивных изотопов со своими индивидуальными ядерно-физическими характеристиками. Самый популярный в life science радиоизотоп йода — 125I. Фирма "Амершам" (Amersham) очень гордится тем, что предлагает исследователям 125I с очень высокой радионуклидной чистотой — содержание примесного 126I менее 0,01%. В то же время, практически для всех исследований в life science, включая радиоиммуноанализ, эта характеристика не является важной, и содержание других радиоактивных изотопов йода в целевом 125I может быть 0,1% и даже 1% без какого-либо ущерба для биологического осмысления полученных результатов.
5.2. Радиохимическая чистота [ % ]
Радиохимическая чистота (РХЧ) — это содержание основного вещества, которое определяется обычно хроматографически (ВЭЖХ или ТСХ) в двух разных системах (условиях). Как правило, РХЧ не ниже 95%. Для большинства исследователей в life science РХЧ начинает представлять интерес, когда они "угробили" эксперимент и пытаются понять почему это произошло.
5.3. Объемная активность [МБк/мл (мКи/мл)]
Иногда объемную активность называют концентрацией радиоактивности (radioactive concentration), что вполне отражает суть. На все производимые меченые соединения в паспорте (сертификате) обязательно указывается дата паспортизации и "reference data" — дата, на которую дается значение объемной активности. Большинство препаратов для life science, особенно соединения, меченные фосфором-32 или 33, имеют высокую объемную активность, и перепроверять (перемерять) заново величину, указанную в паспорте, просто жалко — слишком большой расход материала. Так что исследователи просто рассчитывают необходимую им для работы активность, исходя их данных паспорта с учетом периода полураспада используемого радионуклида. Естественно, что учет распада радионуклида проводится для короткоживущих радиоактивных изотопов: фосфора, серы и йода, а для трития, и тем более для 14С этого не делают.
5.4. Молярная активность [Бк/моль (Ки/ммоль)]
Молярная активность — это активность одного моля вещества, содержащего какой-то радионуклид. Устаревшие единицы измерения Ки/ммоль по-прежнему используются и даже чаще, чем современные Бк/моль. Это просто удобнее, т.к. величина высокой молярной активности (например, фосфора-32), выраженная в Бк/моль, часто вызывает у биологов панику. Сравните: 5000 Ки/ммоль равно 1,85х1017 Бк/моль.
В зарубежной научной литературе чаще используется термин "специфическая активность" (specific activity), который является синонимом молярной активности.
В русскоязычной литературе существует термин "удельная активность" — активность одного грамма (иногда микрограмма) вещества, содержащего радионуклид. Обычно такая характеристика дается соединениям, молекулярный вес которых не определен или не известен. Например, препараты биополимеров (ДНК, РНК, белков) обычно характеризуют удельной активностью — активностью одного микрограмма вещества. В англоязычной литературе термин "специфическая активность" (specific activity) означает и молярную, и удельную активность.
Молярная активность — важнейшая характеристика меченого соединения, причем по нескольким причинам.
Во-первых, вы можете оценить долю собственно меченых соединений в препарате, предложенном вам для работы. Например, если препарат L-[35S]-метионина имеет молярную активность 300 Ки/ммоль, то, учитывая теоретическую молярную активность (1491 Ки/ммоль) для серы-35, нетрудно подсчитать, что в препарате только пятая часть молекул содержит изотоп 35S (300 : 1491 = 1/5), а остальные — "холодные" молекулы — не содержат радиоактивных атомов. Во-вторых, можно подсчитать молярную концентрацию меченого препарата. Для этого надо разделить объемную активность препарата (Ки/мл) на его молярную активность (Ки/ммоль) и получить концентрацию вещества в растворе в ммоль/мл (моль/л). Только будьте внимательны к единицам и множителям, чтобы не разделить объемную активность в мКи/мл на молярную активность в Бк/моль (или наоборот).
В-третьих, вы можете оценить предельно достижимую для вашего препарата чувствительность обнаружения соединения. Так, если ваш препарат [γ-32P] ATP имеет молярную активность 1000 Ки/ммоль, то, учитывая границу достоверной количественной регистрации фосфора-32 в 10-10 Ки, вы сможете определить 10-10 / 103= 10-13 ммоль, т.е. 10-16 моль вещества. К сожалению, эта замечательная чувствительность на практике часто остается недостижимой, т.к. в количественных измерениях в life science обычно "биологический фон" эксперимента гораздо выше физического или приборного. Это подробно будет обсуждаться на примере использования соединений, меченных фосфором-32.
Следует подчеркнуть один очень интересный феномен, связанный с молярной активностью. Если молярная активность меченого препарата близка к теоретически возможной (более 90% от максимальной), то, независимо от периода полураспада радионуклида, величина молярной активности препарата будет практически постоянной. Это хорошо видно на примере 33Р-ортофосфорной кислоты с молярной активностью около 5000 Ки/ммоль. Действительно, согласно схеме радиоактивного распада фосфор-33 превращается в серу-33 и, следовательно, вместе с убыванием количества радиоактивных атомов (распадом) убывает (уменьшается) количество молекул фосфорной кислоты, т.к. из фосфорной H333РO4 образуется серная (H233SO4).
6. Радионуклид 3Н (тритий)
Тритий — радиоактивный изотоп водорода, "чистый" β-излучатель, который легко нарабатывается в реакторе в значительном количестве.
Схема распада: 3Н —> e + 3He
Для life science тритий является самым востребованным и удобным радионуклидом по нескольким соображениям. Во-первых, практически любую органическую молекулу можно пометить тритием (лишь бы содержала водород). Во-вторых, тритий легко вводится в разные соединения, и химия этих процессов разработана лучше, чем для любого другого радионуклида. В-третьих, тритий — это самый дешевый радионуклид, из используемых в life science. Есть прекрасная подробная монография по синтезу соединений, меченных тритием, (В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Н.Ф. Мясоедов, "Меченные тритием липофильные соединения" Москва, изд. "Наука" 2003г.), поэтому я только кратко перечислю основные методы получения 3Н-соединений.
