Хроматография на угольной колонке удобна еще и тем, что угольная колонка обладает высокой емкостью, а это позволяет количественно выделить компоненты и разделить большие количества материала. На эффективность разделения не влияет присутствие неорганических солей или степень разведения раствора сахара. В лабораториях некоторых исследователей для дезактивации угля применялась концентрированная соляная кислота. Элм, Вильямс и Тизелиус насыщали уголь стеариновой кислотой (1% кислоты в 96%-ном спирте). Предварительная дезактивация или насыщение увеличивает возврат введенных в колонку веществ почти до 100%, позволяет элюировать сильно адсорбирующиеся высшие олигосахариды и улучшает разрешение зон. Чтобы исключить малое количество растворенного неорганического вещества, вносимое с наполнителем, указанные авторы часто считали удобным готовить колонки без целита. Если исключить целит проведение операций значительно упрощается в том случае, когда вместе целита применяют уголь двух степеней измельчения: смесь крупнозернистого угля и обычного дарко G-60.
МЕТОДИКА. (описано применение колонки, содержащей только уголь.). Равные весовые части угля дарко G-60 и целита № 535 смешивают в сухом виде, к смеси прибавляют воду и полученную жидкую пасту помещают в стеклянную хроматографическую колонку, закрытую снизу стеклянной ватой. Через колонку медленно, по каплям пропускают концентрированную соляную кислоту, чтобы дезактивировать уголь и отмыть следы железа и золы. После этого через колонку пропускают дистиллированную воду до получения нейтрального элюата. Для уменьшения длительности операций на этой и всех последующих стадиях можно применять отсасывание.
Сахара вводят в колонку в виде водного обычно 1—10%-ного раствора. Для эффективного разделения на каждый грамм смеси сахаров берут 150 мл смеси угля и целита. Разделение сахаров можно проводить как ступенчатым, так и градиентным элюированием. Например, смесь, содержащая по 1 г d-глюкозы, мальтозы и рафинозы, была разделена в колонке 3,4 X 17,0 см последовательным элюированием 800 мл воды, 1500 мл 5%-ного спирта и 700 мл 15%-ного спирта.
Для того чтобы избавиться от растворенного неорганического вещества, которое неизбежно сопутствует в целите, обычно применяют два метода. Так как неорганическое вещество становится относительно мало растворимым, после того как оно было высушено, исследуемый образец выпаривают досуха, смешивают с небольшим количеством воды и фильтруют. Такую операцию повторяют трижды, и этого обычно достаточно для удаления неорганического вещества. Другой способ заключается в следующем: к водному раствору прибавляют метиловый или этиловый спирт, смесь нагревают до 60° и выпавший хлопьевидный осадок удаляют фильтрованием.
2. Хроматография на колонке с целлюлозой/5/
Распределительная хроматография была впервые применена для разделения углеводов в 1949 г. С тех пор этот метод широко используется в препаративной химии углеводов. Область применения этого метода в химии углеводов настолько обширна, что нет необходимости рассматривать частные примеры его использования.
МЕТОДИКА. В качестве колонок можно использовать обычные хроматографические трубки. Успех всякого разделения на распределительной колонке с целлюлозой зависит от четкости границ зон и объемного разделения между зонами. Четкость границ возрастает, если диаметр колонки уменьшается. Объемное разделение между зонами улучшается при возрастании высоты колонки. Но по мере того как высота колонки возрастает и уменьшается ее диаметр, уменьшается и количество материала, которое можно разделить на колонке, возрастает капиллярное сопротивление и уменьшается скорость потока жидкости, орошающей колонку. Эмпирически найдено, что соотношение высоты и диаметра колонки должно быть равно 9:1. Количество вещества, которое можно ввести в колонку, зависит от легкости разделения компонентов. Загрузка для каждого индивидуального компонента приблизительно пропорциональна величине его.
Наполнение колонки является наиболее важной при проведении хроматографии на целлюлозе. На фарфоровый фильтровальный диск, который служит дном обычной хроматографической колонки, вначале помещают либо кусочки фильтровальной бумаги, либо стеклянное волокно. После этого в колонку загружают промытый водой и высушенный стандартный порошок целлюлозы. Для заполнения колонки можно применять сухой порошок целлюлозы, суспензию целлюлозы. Для приготовления суспензии обычно используют ацетон. Порошок целлюлозы смешивают с ацетоном в гомогонизаторе Уоринга до тех пор, пока не получится однородная суспензия средней консистенции. Полученную суспензию переносят в стеклянную трубку. Ацетон стекает через дно трубки, а суспензию медленно перемешивают стеклянной палочкой как раз над линией оседания для равномерного заполнения трубки и чтобы предупредить образование трещин. Хроматографическая трубка все время должна быть почти доверху заполнена суспензией. Когда колонка заполнена на нужную высоту, ацетону дают стечь, тщательно следят за тем, чтобы не обнажалась поверхность целлюлозы. Сверху на слой целлюлозы помещают кусочек пористой фильтровальной бумаги. После этого колонку в течение нескольких дней тщательно промывают растворителем, который будет применяться для орошения колонки при хроматографировании. Колонка должна быть всегда заполнена жидкостью, так как, если она стечет или испарится, объем целлюлозы может уменьшиться и у стенок трубки могут образоваться зазоры. Когда растворитель проходит через колонку, частички целлюлозы поглощают воду и разбухают, образуя плотный слой. Плотность заполнения определяется консистенцией применяемой суспензии. Если суспензия слишком жидкая, набивка будет слишком плотной и возможно частичное фракционирование целлюлозы по размерам частиц.
Если нужно приготовить колонку для хроматографирования с большей скоростью потока, при заполнении ее вместо ацетона можно применить более вязкий растворитель н-бутанол. Для колонок с менее плотной набивкой некоторые исследователи предпочитают готовить суспензию на том же растворителе, который будет применяться для колонки при хроматографировании.
При работе с препаративными колонками, в частности с колонками значительной высоты, в тех случаях, когда желательно увеличить скорость тока раствора, лучше применять избыточное давление. Применение вакуума в последнем случае часто приводит к уменьшению количества растворителя в нижней части колонки и последующему нарушению разделения в этой зоне.
Равномерность заполнения колонки можно проверить, пропуская через нее раствор красителя, например метилрота, в растворителе, который будет применяться. Для этого растворителю дают стечь с верха колонки, после чего добавляют из медицинской капельницы приготовленный раствор красителя, равномерно распределяя его по поверхности целлюлозы, а затем вымывают растворителем, возвращая на место резервуар с растворителем, как только окрашенная зона начнет двигаться вниз вдоль колонки. Если краситель движется вдоль колонки как горизонтальная окрашенная зона, колонка заполнена равномерно и годна к употреблению. Если окрашенная зона движется неровно, колонка заполнена неправильно и ее нужно заполнить снова.
Наиболее удобные растворители для колонки определяются посредством хроматографии на бумаге. Большинство растворителей, применяемых в хроматографии на бумаге, можно использовать для колонки при хроматографировании на целлюлозе. Однако муравьиная кислота, если ее применять в течение длительного времени для колонки с целлюлозой, вызывает деструкцию целлюлозы и колонка становится неприемлемой для дальнейшей работы. Кроме того, муравьиную кислоту трудно удалить из элюата, поэтому применения ее следует избегать.
Если используемый растворитель содержит кислоту (например, уксусную) или основание (например, пиридин), их следует удалить из илюата, прежде чем начать упаривание последнего, чтобы избежать изменений выделяемых сахаров или их производных. С этой целью элюат обычно встряхивают в делительной воронке с равным объемом воды, а затем водный слой экстрагируют эфиром в течение нескольких часов в экстракторе. Эта методика не применима к таким производным сахаров, как, например, метиловые эфиры, и в этих случаях для удаления кислот и оснований нужны особые методы.
Все органические растворители, которые применяются для колонок при хроматографировании на целлюлозе, перед употреблением следует перегнать, чтобы избежать появления масел и смол при последующем концентрировании фракций.
Колонку следует помещать в комнате с постоянной температурой — обычно 20—25°, хотя иногда необходима и более высокая температура, так как при этом возрастает скорость потока и можно использовать более высокие концентрации реагентов. Необходимо избегать колебаний температуры, так как понижение температуры может привести к выделении воды из раствора и нарушить разделение. Это обстоятельство особенно существенно при применении в качестве растворителя н-бутанола, насыщенного водой.
Образец, свободный от неорганических солеобразных веществ растворяют в минимальном количестве воды (фиксируя ее объем). К раствору добавляют сухой порошок целлюлозы в таком количестве, чтобы порошок был увлажнен, и к полученной смеси прибавляют дополнительное количество органических компонентов элюента. Полученную суспензию помещают в колонку поверх слоя целлюлозы. После того как образец немного осядет, поверх него осторожно помещают слой сухого порошка целлюлозы толщиной 2,5 см, накрывают кружком из пористой фильтровальной бумаги и начинают пропускать растворитель для колонки.
Отбор фракций производится с помощью различных автоматически коллекторов; они работают по принципу измерения веса, объема фракций или времени элюирования.
Компоненты можно определить с помощью различных общих цветных реакций. Гарделл применял построение концентрационных кривых элюата и сравнивал их с аналогичными кривыми, полученными для стандартных растворов сахара в том же самом растворителе.
Наиболее простой качественной пробой, по-видимому, является капельная проба: на фильтровальную бумагу помещают каплю элюата и обрабатывают бумагу щелочным раствором нитрата серебра.
Во многих случаях желательно помещать капли вытекающего элюата на хроматографическую бумагу и проявлять ее обычным способом.
3. Тонкослойная хроматография /6/
3.1. КАЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ САХАРОВ
Качественный анализ смесей методом ТСХ позволяет определить
а) число компонентов в анализируемом образце
б) подвижность каждого компонента относительно фронта растворителя.
При качественной тонкослойной хроматографии необходимо учитывать следующие положения:
- При повышении температуры разделение, как правило, ухудшается. Влияние температуры не настолько велико, как в бумажной хроматографии, но, если проявляющая смесь содержит легколетучие растворители, состав ее может измениться.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
