На рис.4 приведена принципиальная схема прибора, используемого для разделения сахаров. Элюент (спирт — вода) помещают в колбу Мариотта и обезгаживают кипячением, чтобы предотвратить появление пузырьков воздуха в колонке. За колбой расположена открытая градуированная трубка, обычно заполненная элюентом. Скорость движения элюента в системе регулируют, перекрывая выходное отверстие колбы. Элюент подается в колонку поршневым насосом из нержавеющей стали который помещают ниже остальных аппаратов системы элюирования..
Рис. 4 Аппаратура для проведения хроматографического разделения и автоматического анализа сахаров орциновым методом.
Давление измеряют манометром Бурдона, снабжённым прерывателем. Последний отключает насос и нагреватель, если давление в системе превышает норму (80 атм) и также если оно падает из-за утечки жидкости. Анализ можно проводить на колонках, имеющих пористое дно и тефлоновое уплотнение на верхнем конце колонки. Если работа ведется при высоком давлении, не рекомендуется пользоваться колонками со стеклянными фланцами. Вместо них можно использовать стеклянные трубки с приклеенными эпоксидной смолой муфтами из поливинилхлорида.
Чтобы в колонке поддерживалась требуемая температура(70-90 °С), по рубашке колонки циркулирует вода из термостата. Повышение температуры колонки приводит к сужению зон вымываемых веществ и снижению рабочего давления.
Смолы, применяемые в распределительной хроматографии, представляют собой сильноосновные аниониты или сильнокислые катиониты, основу которых составляет сополимер стирола и дивинилбензол. В аналитических колонках, диаметр которых равен 2—6 мм, а скорости элюирования высокие (8—20 мл-см-2мин-1), рекомендуется использовать мелкозернистые смолы с размером частиц 8—13 или 10—15 мкм. Для препаративнго разделения сахаров на широких колонках (диаметр 12—25 мм) и при меньшей скорости элюирования можно применять более грубые смолы.
Колонку промывают элюентом до тех пор, пока не образуется однородный слой ионита. После этого растворитель, находящийся над слоем смолы, отсасывают, в колонку переносят новую порцию суспензии и операцию повторяют. Перед хроматографическим разделением заполненную колонку приводят в состояние равновесия с элюентом данного состава, промывая ее элюентом не менее 16 ч.
АНАЛИЗИРУЮЩАЯ СИСТЕМА. Определение сахаров и их различных производных в элюате удобно проводить автоматически орциновым методом. Раствор реагентов хранят в бутыли из темного стекла, откуда он и подается в систему при помощи поршневого насоса. Между насосом и тройником, в котором происходит смешение элюата с раствором красителя, расположено устройство для гашения (демпфирования) пульсаций давления (рис. 4). Смесь элюата с раствором красителя пропускают через змеевик длиной 20 м и диаметром 1,2 мм, погруженный в термостатируемую полигликолевую баню (100°С). Время нахождения смеси в змеевике около 10 мин. Интенсивность окраски раствора определяется спектрофотометрически при 420 нм проточных кюветах с l 2—15 мм. Удобно пользоваться системой из двух последовательно соединенных кювет разной длины: если на более длинной кювете самописец «зашкаливает», измерения проводят на более короткой кювете. На колонке диаметром 4 мм удается разделить и проанализировать от 2 до 20 мкг веществ. На колонках меньшего или большего диаметра можно проанализировать соответственно меньшее или большее количество смеси.
Достоинством вышеописанной схемы анализа является высокая точность количественного определения и отсутствие необходимости в частом построении калибровочных кривых (при постоянстве условий анализа). Если удается достичь полного разделения компонентов, отклонение от среднего значения в двух аналогичных анализах составляет 1енее 1%. Однако весь элюат расходуется за одно определение, и потому не удается провести дополнительное исследование фракций.
Если проводится препаративное разделение или если проводимые исследования требуют повторного разделения и дополнительных анализов компонентов смеси, то для разделения потока элюата и введения растворов реагентов следует использовать перистальтический насос. Такая схема анализа (рис. 5) отличается большей гибкостью, однако недостатком ее является более низкая точность количественных определений в связи с тем, что соединительные трубки насоса быстро изнашиваются и их приходится менять через 14 дней.
Рис. 5. Двухканальный анализатор для одновременного определения восстанавливающих сахаров и альдитов.
М- сместители; Р1 и Р2 – гасители пульсации; L – флуоресцентная лампа трубки; А – орционный канал: 16-ти % водный раствор орциона, 60% серная кислота; В – периодат-формальгидный канал: 0,015Мметапериодат натрия, содержащий 5 мл конц. соляной кислоты на литр
На рис.5 приведена схема анализа с применением перистальтического насоса. Элюат делится на три потока и одновременно анализируется орциновым (А) и периодат-формальдегидным (В) методами. Третий поток подается на коллектор фракций или отбрасывается. В элюате дополнительно определяют содержание восстанавливающих сахаров периодатным или феррицианидным методом. Выделенные ациклические альдиты анализируются автоматически периодат-формальдегидным методом. В кислой среде они окисляются периодатом с образованием формальдегида, который определяют до реакции с пентандионом-2,4 в растворе ацетата аммония. Избыток периодата предварительно восстанавливают арсенитом. В условиях анализа при окислении большинства альдитов образуется с высоким выходом формальдегид, в то время как при окислении большей части альдоз формальдегид образуется лишь в незначительных, с трудом детектируемых количествах. Исключение составляет D-фруктоза, ее можно достаточно точно определить этим методом. Периодат-формальдегидегидный метод в совокупности с орциновым используется для анализа сложных смесей сахаров и альдитов. Точность его сравнима с точностью орцинового метода.
6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
В последнее время хроматографию на бумаге все чаще начинают использовать в качестве самостоятельного количественного метода. При этом весьма широкое распространение получает количественная хроматография углеводов: моно-, ди- и олигосахаридов, а также продуктов гидролиза крахмала, целлюлозы и других полимеров. Количественное определение индивидуальных веществ, разделяемых на хроматограммах, производится различными способами. Существует ряд методов, при помощи которых можно определить концентрацию разделенных веществ непосредственно на бумаге. Это методы: визуальное сравнение (полуколичественный), измерение площади пятен, измерение интенсивности окраски пятен, определение максимальной плотности окраски пятен. В случае работы с радиоактивными веществами можно легко установить активность этих соединений при помощи счетчика Гейгера — Мюллера.
Однако более широко применяемым и, по-видимому, наиболее точным методом является элюирование отдельных соединений с последующим колориметрированием или определением поглощения в ультрафиолетовой области. При работе с радиоактивными веществами можно производить измерение общей или удельной активности элюируемого вещества.
Точность методов количественного хроматографического анализа равна 10%.
7. ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ТРИМЕТИЛСИЛИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ САХАРОВ
Газожидкостная хроматография (ГЖХ) триметилсилиловых эфиров (ТМС) производных углеводов представляет собой хорошо отработанный метод, который в течение ряда лет используется для анализа сложных смесей сахаров, таких, как кукурузная патока или в общем случае гидролизаты полисахаридов. С совершенствованием методов силилирования создавалась новая хроматографическая аппаратура и изыскивались новые жидкие фазы. Все это позволило не только улучшить разделение сложных смесей сахаров, но и расширить область применения ГЖХ вплоть до разделения гептасахаридов. Бробст и Лотт разработали метод, позволяющий проводить анализ образцов, содержащих небольшие количества воды, и, используя его, смогли определить олигосахаридный состав кукурузной патоки вплоть до тетрасахаридов. Позднее в качестве силилирующего агента стал использоваться N-(триметилсилил) имидазол и смесь его с пиридином, ставшая коммерческим реактивом. Показано, что данный реактив обладает хорошими растворяющими свойствами и может использоваться для силилирования влажных образцов сахаров.
Этот метод не только допускает наличие в образце до 40 мг воды, но и существенно увеличивает устойчивость триметилсилиловых эфиров, так как в смеси присутствует большой избыток реагента. Поэтому стандартная калибровочная смесь устойчива в течение нескольких месяцев, что весьма важно для хранения контрольных образцов редких олигосахаридов.
8. ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ МЕТИЛИРОВАННЫХ САХАРОВ
Газожидкостная хроматография представляет собой надежный и широко распространенный метод качественного и количественного анализа сахаров. Разделение методом ГЖХ метиловых эфиров сахаров и их производных приобрело особенно большое значение при исследовании структуры олиго- и полисахаридов. Восстанавливающие метилированные сахара нельзя изучать методом ГЖХ в первую очередь потому, что они прочно сорбируются на неподвижной фазе или носителе, и их, как правило, переводят в метилгликозиды. Последние либо непосредственно анализируют на газовом хроматографе, либо, если время удерживания метилгликозидов слишком велико, предварительно ацетилируют или силилируют.
Иногда разрешающая способность колонки недостаточна для разделения аномеров пиранозных и фуранозных форм некоторых метилированных гликозидов или их производных. В таком случае метилированные сахара анализируют в виде ацетатов или триметилсилиловых эфиров альдитов.
Как было установлено, детекторы дают различный отклик на различные метилированные сахара, содержащиеся в одинаковых концентрациях. Однако пока не известно, является ли это следствием особенностей, присущих детекторам, или следствием потерь некоторых компонентов при подготовке образца к анализу и преимущественной сорбции их на колонке. Твердые правила выбора колонки еще не выработаны. Тем не менее изучение литературных данных показывает, что большинство исследователей предпочитают полярные фазы, которые, по-видимому, дают лучшее разрешение всех типов производных метилированных сахаров. Обычно время удерживания соединения выражают по отношению ко времени удерживания стандарта. Это позволяет избежать расхождений, наблюдаемых для абсолютных значений времени удерживания и обусловленных нестандартностью условий анализа. Результаты определения относительного времени удерживания на одной и той же колонке воспроизводятся с точностью до ±2%, а на разных колонках с одинаковыми неподвижными фазами - с точностью до ±5%.
Время удерживания многих производных углеводов достаточно велико, что приводит к плохому разделению смесей, обусловливает низкую концентрацию элюируемых компонентов в газе-носителе, и в итоге приводит к увеличению ошибки при определении содержания компонентов в смесях. Поэтому при проведении разделения метилированных сахаров желательно подбирать такие производные и такие условия работы, при которых все компоненты смеси элюировались бы с колонки в течение 70—90 мин с момента их введения. Если детектирование не сопровождается разрушением сахаров, их можно собирать на выходе с хроматографа.
Заключение
Хроматографические методы при разделении и очистке полисахаридов, так же как и в других областях химии природных соединений, играют исключительно важную роль. Однако вследствие своеобразия полисахаридов далеко не все разновидности хроматографии используются в равной мере. Наличие даже в очищенных полисахаридах набора полимерогомологов с близкой хроматографической подвижностью и близкими сорбционными свойствами, их коллоидный характер, а также склонности к ассоциациям – все это обусловливает малую эффективность таких видов хроматографии, как бумажная, распределительная и адсорбционная хроматография.
Вместе с тем ионообменная хроматография имеет исключительно важное значение при разделении и очистке полисахаридов.
Широко применяемые ДЭАЭ-целлюлоза и эктеолацеллюлоза позволяют легко отделить нейтральные и кислые полисахариды: нейтральные обычно не задерживаются или мало задерживаются на названных анионитах, кислые, в зависимости от своей природы, более или менее прочно удерживаются и элюируются растворами солей, буферными растворами или щелочами. На анионитах разделяются различные кислые полисахариды в зависимости от степени их кислотности. Применение ДЭАЭ-целлюлозы в боратной форме позволяет разделять и нейтральные полисахариды. Недавно были разделены нейтральные полисахариды (гликоген) при помощи ДЭАЭ-целлюлозы на фракции, отличающиеся величиной частиц./3/
Для разделения сахаров применяются следующие методы:
1. Хроматография на колонках с углем применяется для разделения углеводов на классы в зависимости от степени их полимеризации (моносахариды, дисахариды, трисахариды т. д.).
2. Хроматография на колонке с целлюлозой имеет широкую область применения, что нет необходимости рассматривать частные примеры его использования.
3. Качественная тонкослойная хроматография применяется для разделения углеводов, в том числе незамещенных моно- и олигосахаридов и различных производных сахаров и сложных эфиров, циклических ацеталей и др.
4. Количественная тонкослойная хроматография сахаров может применяться в случае смесей, компоненты которых можно полностью разделить
5. Препаративная тонкослойная хроматография сахаров используется для разделения смеси аномерных сахаров( метил-2,3,6-три-О-бензил-4-О-этил-a,b-D-глюкопиранозидов).
6. Газожидкостная хроматография используется для разделения триметилсилильных производных сахаров, метилированных сахаров.
Из своей теоретической работы я могу сделать следующие выводы:
- для идентификации олигосахаридов наилучшим методом считается бумажная хроматография
- для разделения сахаров наилучшим методом считается тонкослойная хроматография.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Чмутов К.В. Хроматография, ее теория и применение. - М.: Издательство Академии наук СССР –1960г.
2. Хомченко Г.П. Химия для поступающих в вузы: Учеб. пособие. 2-е изд., -М.: В. ш., 1995г.
3. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды): Учеб. пособие для вузов. – М.: Высш. школа, 1978г.
4. Жуховицкий А.А. Руководство по газовой хроматографии. – М.: Мир, 1969г.
5. Кочетков Н.К. Методы химии углеводов. - М.: Мир, 1967г.
6. Хорлин А.Я.Методы исследования углеводов.- М.:Мир, 1975г
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
