Другой, еще более простой метод был разработан Томпсоном и др. [1.7] для исследования микроструктуры капель тумана, однако его можно использовать и в случае биологических объектов. Луч от импульсного лазера падает на частицы вблизи фотографической пластинки. Дифрагированный свет от частиц интерферирует с недифрагированным светом, образуя голограмму. В этом случае, так же как и при оригинальной габоровской голограмме [1.2], на стадии восстановления наблюдались три перекрывающихся волновых фронта, соответствующих непродифрагированному восстанавливающему лучу, мнимому изображению объекта и действительному изображению объекта. Часто одно из этих изображений совпадало с расфокусированным изображением другого (с сопряженным изображением).
Томпсон и др. показали, что при коллимированиом опорном и восстанавливающем пучках и голограмме, находящейся в дальней области, одно изображение можно удалить на бесконечность, т.е. наблюдать так далеко от фокуса, что оно будет пренебрежимой помехой при наблюдении другого изображения. За одну экспозицию лазерным импульсом записывают формы и положения всех частиц вблизи записывающей среды. По чисто техническим причинам (см. приложение) мы не можем наблюдать все частицы одновременно. Однако мы можем исследовать их по сечениям. При воспроизведении наблюдаются изображения частиц как в фокусе, так и вне его. Передвигая экран для наблюдения или видикоп на различные расстояния от голограммы, мы можем наблюдать, как изображения входят и выходят из фокуса. Изображение находится в фокусе, когда его размеры и окружности вокруг него минимальны.
Рис. 1.2.
Фотографии изображений, восстановленных с одного кадра микрокиноголограммы. Показана различная глубина фокуса, что можно видеть по появлению и исчезновению капилляров из фокуса. Можно видеть пузырьки, проходящие по центральной артерии (С разрешения М. Е. Кокса, Университет Мичиган-Флинт).
Рисунок 1.3. Обычная схема записи голограмм
Рис. 1.4 Предпочтительная схема записи голограмм
Было реализовано несколько интересных биомедицинских применений. Один из наиболее наглядных примеров следует из работы Ботнера и Томпсона [1.8] по волокнистым материалам, которые из-за своих размеров не фильтруются нашими дыхательными органами и вследствие этого являются потенциально токсичными. На рис. 1.5,а показана голограмма. Буквы Л, В, С указывают местоположения в плоскости х—у трех частиц, находящихся на различных глубинах. На вставках б, в и г показаны сами частицы в плоскостях наилучшей фокусировки. Таким образом, рис. 1.5 демонстрирует, как осуществляется голографический анализ микрочастиц. Каждая дифракционная картина на голограмме есть указатель частицы, находящейся на одной оси с опорным пучком в момент излучения импульса лазера. Освещая эту картину (голограмму отдельной частицы) копией опорного пучка, только противоположно направленной, мы формируем точное действительное изображение частицы (подверженное дифракционным ограничениям, накладываемым размером голограммы, размером частицы и расстоянием частицы от пластинки). Если бы объектом была математическая точка на расстоянии d от записывающей среды, ее голограмма была бы похожа на френелевскую зонную пластинку с фокусным расстоянием d.
Таким образом, имеем концентрические кольца с радиусом:
,
где п — целое число, а л — длина волны лазера.
Рис. 1.5. Голограмма Фраунгофера (а) волокнистых частиц и изображения отдельных частиц (б, в, г), восстановленные с участков голограммы А, В, и С соответственно (С согласия Ботнера и Томпсона [1.8]).
Эффективный диаметр Dэфф голограммы ограничен из-за того, что при некотором п расстояние между соседними кольцами становится слишком маленьким для разрешения. При восстановлении поперечное разрешение ограничивается дифракцией:
.
Для практических целей можно разрешить детали, сравнимые с л. Можно обнаружить меньшие частицы, но нельзя определить их форму. Изображениями их являются просто кольца диаметром . К сожалению, изображение выходит из фокуса таким образом, что на глубинах, отличных от d, мы все еще наблюдаем создаваемую частицей картину. Мы знаем, что находимся на нужной глубине, если изображение имеет минимальный размер и, в идеале, не имеет структуры концентрических колец. Таким образом, передвигают проекционный экран или видикон на различные расстояния с тем, чтобы найти истинное значение d. Такая операция может быть легко автоматизирована. Все эти методы требуют лазерного освещения, а оно приводит к специфическому эффекту лазерных спеклов (зернистой структуры лазерного освещения). Природа лазерных спеклов и возможности борьбы с ними широко исследовались в течение многих лет, и существует много «решений» (значительно различающихся по сложности и практичности) [1.9, 10]. Многие из этих решений пригодны только в особых случаях, для которых они были разработаны, и ни одно из них не является универсальным средством подавления спеклов. Возможно, эти вездесущие пятнышки являются первичным барьером на пути более широкого применения голографической микроскопии. На рис. 1.6 показано изображение спеклов до и после операции их подавления. В данном случае спеклы были устранены (минимизированы) просто с помощью формирования изображения при большой числовой апертуре. Обычно размеры спеклов дифракционно-ограничены, они становятся меньше по мере увеличения числовой апертуры.
1.2 Формирование трехмерного оптического макроскопического
изображения
Для нас, людей, наиболее интересными являются макроскопические биологические объекты, а именно мы сами и наши важнейшие «составные части». Мы хотим получать изображения и производить измерения. Когерентная оптика все это выполняет.
Рис. 1.6. Одно и то же изображение со спеклами и без спеклов.
Измерения можно отделить от формирования изображений. В этом разделе мы будем иметь дело исключительно с формированием оптических изображений средствами когерентной оптики. В качестве конкурента здесь выступает обыкновенная фотография.
Голография является очевидным подходом к решению вопроса о формировании биологического изображения. Гара и др. [1.11] было детально описано устройство для записи и измерения точной трехмерной информации о больших объектах. Голограмма записывалась при помощи обыкновенного импульсного лазера. Для получения трехмерного изображения с точными размерами при восстановлении мы должны использовать ту же длину волны, что и при записи. Причина вполне понятна. Голограмме, подобно линзе, присущи ограничения, связанные с фундаментальными законами дифракции. Так, если R есть отношение длины волны света, используемого при восстановлении, к длине волны записывающего света, то поперечное увеличение системы равно R, но продольное увеличение будет равно R2. Это означает, что оба увеличения равны только в случае, если R = R2 , т.е. R=l. Таким образом, чтобы получить реальное неискаженное изображение, мы должны освещать голограмму восстанавливающим пучком, идентичным опорному пучку во всех отношениях, кроме одного: восстанавливающий луч обратен по направлению. Гара и др. [1.11] производил запись с помощью импульсного лазера, с тем чтобы «заморозить» движение объекта, а затем воспроизводил реальное изображение с помощью лазера, работающего в непрерывном режиме с той же длиной волны.
И, наконец, изображение сканировалось в трех измерениях с целью описания объекта как поверхности, находящейся на расстоянии S(x, у) от плоскости голограммы в каждой точке (x, у) в этой плоскости. Полезность этого метода для формирования изображения всего тела очевидна. Необходимость же иметь такое детализированное изображение всего тела не так очевидна, так что этот мощный инструмент ждет задачи, оправдывающей затраты на него. Пригодность этого метода для биологических задач была продемонстрирована при формировании изображений моделей черепа с последующим выделением профилей. На рис. 1.7 показаны горизонтальные профили модели, сделанные Гара и др. [1.11]. Были сделаны как микрометрические, так и голографические измерения положения меток, нанесенных на череп. Среднеквадратичное значение разницы между указанными координатами равнялось — 40 мкм. Ту же самую задачу по выделению трехмерных координат поверхности для свободно расположенных объектов пытались решить другими, существенно некогерентными методами. Эту задачу можно назвать «стереометрией». Стереометрия не подразумевает классическую стереофотографию или «фотограмметрию*. Скорее, это есть общее название, данное любому методу трехмерного измерения (не обязательно формированию изображений).
Рис. 1.7. Профили модели черепа, полученные при помощи голографического метода Тара и др. [1.11] (С разрешения исследовательской лаборатории фирмы General Motors Corporation)
Наиболее распространенным видом стереометрии является расчет на ЭВМ или даже когерентно-оптическая расшифровка стереофотографических пар [1.12]. Новый метод, использующий временные задержки для кодирования пространственной информации [1.13], непосредственно выдает стереометрическую информацию о нескольких тысячах точек в секунду. Точность определения глубины этим последним методом (называемым лазерной стереометрией) на порядок хуже точности метода Гара и др., но зато информация поступает в реальном времени и отпадает необходимость в вычислительной машине.
Так как лазерная стереометрия не использует когерентность лазера, мы не будем здесь ее рассматривать. Она упоминается для того, чтобы оставить определенные перспективы п будущем для голографической стереометрии. Это медленный метод, требующий большой осторожности при пользовании им, но с его помощью достигается большая точность, чем в каком-либо другом методе. И снова неголографические методы оказываются почти такими же хорошими и более простыми, чем голографические.
Разумеется, могут быть успешно использованы и менее разработанные голографические методы. Основным преимуществом их оказывается возможность трехмерной записи. Вопрос состоит не в том, что можно сделать, а в том, для чего нужна эта техника. Для чего именно нужна запись с полной трехмерной точностью? Редкий патологический объект? Действия уникально квалифицированного хирурга в редкой операции? Последний почтовый голубь? Что бы это ни было, оно должно быть достаточно редким, чтобы оправдать запись полностью, и достаточно важным, чтобы оправдать трудности голографирования. На сегодня выяснен только один ответ: голография с помощью оптических элементов (линз) становится широко распространенным средством для записи сетчатки и внутренней полости глаза [1.14].
1.3 Формирование двумерного изображения
Несмотря на то, что не существует объектов — биологических или каких-либо других, имеющих строго два измерения, имеются реальные преимущества для записи двумерных изображений в биологии и медицине, так же как и реальные преимущества использования голографии для этих целей. Рассмотрим сначала применения, а потом использование голографии в них.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
