- *.GRP - файл, содержащий список базисных спектров КД (принадлежащих одной из базисных групп).
- *.STR - файл, содержащий набор структурных типов (элементов вторичной структуры белка).
После запуска файла structur.exe на экране появляется главное меню программы, состоящее из следующих пунктов:
1. File - создание и редактирование файлов данных;
2. Group - создание и редактирование групп базисных спектров КД белков;
3. Calculate - выбор метода анализа, анализируемого спектра, группы базисных спектров, запуск вычислений и просмотр результатов;
4. Options - выбор набора структурных типов;
5. Setup - изменение цветового оформления окон программы;
6. Quit - выход из программы.
В нижней части экрана располагаются три окна, содержащие информацию об анализируемом спектре КД (Protein), а также о выбранных для анализа группе базисных спектров (Group) и наборе типов вторичной структуры белка (Structures).
Создание и редактирование файлов данных. Создание и редактирование файлов данных осуществляется с помощью команд меню File/Create и File/Edit соответственно. В файл необходимо внести следующую информацию:
- Комментарий длиной не более 45 символов (пункт меню Comment).
- Идентификатор длиной не более 7 символов, который становится именем файла и автоматически приобретает расширение.dat (пункт меню Identificator).
- Содержание в белке (относительные доли) различных типов вторичной структуры по данным рентгеноструктурного анализа (пункт меню Structure data). Эти данные необходимы только в случае использования вводимого спектра в дальнейшем в качестве базисного.
- Диапазон и шаг по длинам волн, а также сам спектр КД (пункт меню Spectrum). Для программы CDESTIMATE диапазон анализируемого спектра не должен быть шире, чем 240 - 190 нм, а шаг должен быть равен 1 нм или больше. Для программы CONTIN число точек в анализируемом спектре не должно превышать 51. Для программ CONTIN, VARSELEC и PROVCD диапазон анализируемого спектра не должен быть шире диапазона базисных спектров, а шаг должен совпадать с шагом базисных спектров.
После ввода всей перечисленной выше информации необходимо сохранить ее с помощью пункта меню Save. При необходимости можно построить введенный спектр КД на экране в графическом виде с помощью пункта меню View.
Команды меню File/Load и File/Delete используются соответственно для добавления новых спектров в список рабочих спектров, запоминаемых программой, и для удаления из него ненужных спектров. Для добавления нового спектра с помощью команды Load необходимо указать имя файла, в котором он хранится (предварительно его надо записать в текущий каталог). При удалении какого-либо спектра из списка с помощью команды Delete соответствующий ему файл не удаляется, поэтому его всегда можно будет включить обратно в список с помощью команды Load.
Создание и редактирование групп базисных спектров. В программе STRUCTURE уже существует 6 предопределенных групп базисных спектров, соответствующих различным методам анализа спектров КД. Эти группы имеют следующие имена:
- PG_3_16.GRP и PG_4_16.GRP - базисные наборы, состоящие из 16 спектров, использованные для анализа авторами метода "регуляризации" [4] (Provencher & Glockner), предназначенные для определения вторичной структуры по 3 и 4 структурным классам соответственно (смотри ниже);
- PG_3_20.GRP и PG_4_20.GRP - базисные наборы, содержащие те же самые 16 спектров, что и в двух предыдущих наборах, плюс 4 спектра денатурированных белков;
- HJ_16.GRP и HJ_22.GRP - базисные наборы, состоящие из 16 и 22 спектров соответственно, использованные для анализа авторами метода "ортогональных спектров" [7] (Henessey & Johnson), предназначенные для определения вторичной структуры по 5 структурным классам (смотри ниже).
В программе предусмотрена возможность создания собственных групп базисных спектров. Для этого необходимо воспользоваться командой главного меню Group/Create, позволяющей выбрать из списка существующих спектров те, которые вы хотите включить в свой базисный набор. Аналогичным образом осуществляется редактирование групп базисных спектров (команда главного меню Group/Edit). Удаление группы базисных спектров осуществляется с помощью команды главного меню Group/Delete.
Выбор набора структурных типов. В программе STRUCTURE предопределены следующие 3 набора типов вторичной структуры белка:
|
Provencher 3 (PG3.STR) |
ALFA_hl (a-спираль) BETA_sh (b-структура) Remain (остальные типы) |
|
Provencher 4 (PG4.STR) |
ALFA_hl (a-спираль) BETA_sh (b-структура) BETA_tn (b-поворот) Remain (остальные типы) |
|
Johnson 5 (HJ.STR) |
ALFA_hl (a-спираль) BETA_Ash (антипараллельная b-структура) BETA_Psh (параллельная b-структура) BETA_tn (b-поворот) Other (остальные типы) |
Набор All structures (FULL.STR) содержит дополнительные типы вторичной структуры белка, однако он ни с одной из предопределенных групп базисных спектров не используется.
Каждая группа базисных спектров соответствует одному из выше перечисленных наборов структурных типов. Это соответствие выглядит следующим образом:
PG_3_16.GRP и PG_3_20.GRP - Provencher 3;
PG_4_16.GRP и PG_4_20.GRP - Provencher 4;
HJ_16.GRP и HJ_22.GRP - Johnson 5.
При выборе одной из групп базисных спектров необходимо выбрать соответствующий набор типов вторичной структуры белка. Выбор нужного набора структурных типов осуществляется с помощью команды главного меню Options/Structure types.
Запуск вычислений. Для начала вычислений необходимо воспользоваться командой главного меню Calculate. В появляющемся меню нужно выбрать один из предлагаемых методов вычислений. В появляющемся после этого списке имеющихся белковых спектров необходимо выбрать анализируемый спектр. Если для расчетов были выбраны программы CONTIN, VARSELEC, PROVCD или DEF_CLASS, то необходимо также выбрать группу базисных спектров, на которой будут основаны вычисления. После этого производится запуск вычислений.
Если для расчетов была выбрана программа VARSELEC, то необходимо также установить порядок исключения спектров из исходного базисного набора для процедуры "выбора переменных" с помощью команды главного меню Options/Var.select. Для этого необходимо указать число спектров, исключаемых на каждом шаге вычислений. После его задания автоматически вычисляется общее количество шагов, требуемых для перебора всех возможных комбинаций. Если перебор всех возможных комбинаций не требуется, необходимо указать номер начальной и конечной комбинации.
Время вычислений равняется в среднем 1-3 минутам, однако может составлять значительно больший интервал для программы VARSELEC при задании очень большого количества комбинаций базисных спектров.
Результаты вычислений можно просмотреть с помощью команды Calculate/Result.
2. Инфракрасные спектры поглощения белков
2.1 Поглощение белков в ИК-области
Поглощение света в видимом и ультрафиолетовом диапазонах обусловлено электронными переходами в молекулах поглощающего вещества. Поглощение света в инфракрасном диапазоне имеет иную природу. Оно связано с переходами между колебательными уровнями основного состояния молекулы. Полосы поглощения, отвечающие колебательным переходам, обычно лежат в диапазоне длин волн от 2000 до 50000 нм или, как принято записывать для ИК-спектров, в диапазоне волновых чисел от 5000 до 200 см-1.
Колебательные спектры подчиняются в сущности тем же закономерностям, что и электронные. Однако для колебательных переходов характерна значительно меньшая интенсивность, чем для электронных. Следовательно, при регистрации ИК-спектра образец должен быть гораздо более концентрированным. Кроме этого, многие полосы ИК-спектров белков, в том числе соответствующие пептидным хромафорам, расположены в той спектральной области, где наблюдается сильное поглощение воды. Использование D2О вместо Н2О иногда помогает обойти эту трудность, но не решает проблему полностью, поскольку полная замена лабильных протонов белка на дейтерий часто связана с потерей его нативной конформации.
Описываемый ниже метод определения вторичной структуры белка основан на использовании ИК-спектров поглощения белков в Н2О [8-10]. Проблема, связанная с их измерением, была решена авторами метода с помощью довольно сложной процедуры компенсации поглощения воды и использования очень узких ячеек (с длиной оптического пути около 6-12 мкм). Поскольку все измерения проводились в Н2О трудностей с поддержанием нативной конформации белков не возникало.
Колебательные полосы поглощения обычно порождаются переходами, которые можно довольно точно отнести к определенным химическим связям. В случае белков наиболее интересными являются три инфракрасные полосы, соответствующие колебательным переходам в пептидном остове. Это полосы, связанные с растяжением связи N-H (около 3300 см-1), растяжением связи C=O (1640-1660 см-1, полоса амид I) и деформацией связи N-H (1520-1550 см-1, полоса амид II). Эти полосы довольно легко зарегистрировать, поскольку каждое пептидное звено дает вклад в их интенсивность.
Образование водородных связей при формировании вторичной структуры белка приводит к сдвигу энергии этих трех пептидных колебаний. Первые две полосы, отвечающие валентным колебаниям, смещаются в область более низких энергий, поскольку наличие водородной связи облегчает смещение атома азота амидной группы и атома кислорода карбонильной группы в направлении акцептора или донора протона соответственно. Полоса амид II смещается в сторону более высоких энергий, так как водородная связь препятствует изгибанию связи N-H.
Влияние водородных связей на полосы амид I и амид II в случае a-спирали и b-структуры оказывается различным, что дает возможность использовать ИК-спектры для определения вторичной структуры белков. Ниже представлена таблица, суммирующая данные о влиянии вторичной структуры на положение полос амид I и амид II. В ней приведены положения максимумов (n0) и значения интенсивности в максимумах (Е0) для полос амид I и амид II, усредненные по нескольким модельным полипептидам и фибриллярным белкам в Н2О [9]:
