|
Тип вторичной |
Амид I |
Амид II |
||
|
структуры |
n0, см-1 |
Е0, л·моль-1·см-1 |
n0, см-1 |
Е0, л·моль-1·см-1 |
|
a-спираль |
1647 |
700 |
1551 1520 |
310 80 |
|
b-структура |
1695 1619 |
180 980 |
1533 1563 |
340 100 |
|
неупорядочен- ная форма |
1651 |
320 |
1550 |
210 |
Следует отметить, что расщепление полос амид I и амид II происходит за счет взаимосвязанности колебаний в отдельных пептидных группах.
На рисунке 2.1.1 представлены ИК-спектры трех модельных полипептидов, находящихся в конформациях a-спирали, b-структуры и неупорядоченной формы.
2.2 Методы анализа ИК-спектров белков
В целом, проблемы, решаемые при анализе ИК-спектров белков с целью определения их вторичной структуры, очень схожы с проблемами, возникающими при анализе спектров кругового дихроизма белков. При этом также используется набор ИК-спектров белков с известной вторичной структурой, используемых в качестве базисных. Так, например, в методе, описанном в работах [8-10], анализ базисного набора, состоящего из 13 спектров глобулярных белков и 6 спектров фибриллярных белков и полипептидов в Н2О в диапазоне 1800-1480 см-1, осуществляется с помощью методов "регуляризации" [4] и "ортогональных спектров" [6], рассмотренных выше.
Авторы этого метода вводят дополнительную процедуру, позволяющую исключить вклад в ИК-спектр белка поглощения боковых групп аминокислотных остатков. Ими было показано, что этот вклад составляет около 20% от суммарной интенсивности полос амид I и амид II. Возможность проведения такой процедуры определяется тем, что вклады в ИК-спектр поглощения белка от боковых групп аминокислотных остатков и полипептидного остова являются аддитивными. Для оценки поглощения боковых групп было проведено измерение ИК-спектров водных (Н2О) растворов аминокислот. Оказалось, что наиболее сильно поглощают в исследуемой части ИК-диапазона боковые группы аминокислот аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аргинина, лизина, тирозина, фенилаланина и гистидина. Было обнаружено также сильное поглощение заряженных a-амино - и a-карбоксильной групп аминокислот. Поэтому их поглощение также необходимо учитывать при анализе белкового спектра. Суммарно, ИК-спектр белка может быть представлен в следующем виде:
. (2.2.1)
- спектр поглощения полипептидного остова белка, а - спектр поглощения боковых групп аминокислотных остатков белка, вычисляемый по формуле
, (2.2.2)
где - спектр поглощения k-ой аминокислоты, - число k-ых аминокислот в белке, а - общее число аминокислот в белке. N - и С-концевые - NH2 и - COOH группы белка также должны быть включены в эту формулу наравне с аминокислотами. Пример исключения из ИК-спектра рибонуклеазы А вклада от поглощения боковых групп аминокислотных остатков приведен на рисунке 2.2.1 Таким образом, данный метод анализа ИК-спектров полностью аналогичен методам анализа спектров КД белков, за исключением того, что в нем используются не реальные белковые спектры, а вычисленные с помощью формул (2.2.1) и (2.2.2) спектры поглощения пептидного остова белков.
Авторы метода использовали для анализа шесть типов вторичной структуры белка: упорядоченная (Ho) и неупорядоченная (Hd) формы a-спирали, упорядоченная (Вo) и неупорядоченная (Вd) формы b-структуры, b-изгиб (Т) и остальные формы (R). К неупорядоченной форме a-спирали были отнесены по два аминокислотных остатка с каждой стороны спирального сегмента, а к неупорядоченной форме b-структуры - аминокислотные остатки b-нитей, образующие "неклассические" водородные связи.
Применение к выбранному базисному набору метода "ортогональных спектров" [6] привело к получению 11 ортогональных спектров, амплитуда которых превышает экспериментальную ошибку, возникающую при регистрации ИК-спектров. Пять "наиболее значимых" ортогональных спектров показано на рисунке 2.2.2.
Экспериментальная проверка точности анализа ИК-спектров белков на белках из базисного набора дала следующие коэффициенты корреляции (смотри раздел 1.2):
|
Метод |
Ho |
Hd |
Bo |
Bd |
T |
R |
|
"регуляризации" |
0.97 |
0.77 |
0.94 |
0.91 |
0.80 |
0.48 |
|
"ортогональных спектров" |
0.98 |
0.80 |
0.93 |
0.90 |
0.75 |
0.48 |
|
"регуляризации" (без исключения поглощения боковых групп аминокислот) |
0.92 |
0.68 |
0.85 |
0.90 |
0.53 |
0.32 |
2.3 Работа с пакетом программ STRUC по анализу ИК-спектров белков
Пакет программ STRUC разработан в институте белка РАН [10]. Он предназначен для анализа инфракрасных спектров поглощения белков и определения их вторичной структуры. Алгоритм анализа спектров основан на оригинальном методе авторов программы [8-10] (смотри выше). Пакет STRUC состоит из следующих программ и вспомогательных файлов:
- STRUC.BAT - командный файл, используемый для определения вторичной структуры белка. Он организует работу следующих трех программ:
- AMACIR (файл amacir.exe) - программа, исключающая из ИК-спектра поглощения белка вклад от поглощения боковых групп аминокислотных остатков по методу [8];
- SVDIR (файл svdir.exe) - программа, определяющая вторичную структуру белка методом "ортогональных спектров" [6];
- CONTIR (файл contir.exe) - программа, определяющая вторичную структуру белка методом "регуляризации" [4].
- VISUAL.BAT - командный файл, предназначенный для графического воспроизведения ИК-спектра поглощения белка. Он организует работу следующих двух программ:
- PLOTFL (файл plotfl.exe) - программа, осуществляющая преобразование спектров поглощения к формату, используемому программой PLOTNIK;
- PLOTNIK (файл plotnik.exe) - программа, осуществляющая графическое построение ИК-спектра поглощения белка.
- SOURCE - файл, содержащий входные данные для программы AMACIR (в том числе сам ИК-спектр поглощения белка).
- OUT.SVD и OUT.CON - файлы, являющиеся результатом работы программ SVDIR и CONTIR, содержащие данные по оценке вторичной структуры белка соответствующими методами.
Программы, входящие в пакет STRUC, не имеют системы экранного интерфейса, и работа с ними осуществляется из командной строки. Перед началом работы с пакетом необходимо создать текстовый файл SOURCE (рекомендуется скопировать уже имеющийся) и записать в него исходные данные по исследуемому белку и его ИК-спектру поглощения, необходимые для работы программ. Формат этого файла следующий:
|
Номер строки |
Содержание |
|
1 |
Идентификатор файла (длиной не более 70 символов) |
|
2, 3 |
Формат записи числовых значений спектра в строках 6 - 14. По умолчанию устанавливается формат (10F6.0) - по 10 значений в каждой строке в форме действительного числа с фиксированной десятичной точкой, причем на запись всего числа отводится 6 позиций, из которых 0 позиций - на десятичную часть. (Для действительных чисел с плавающей десятичной точкой вместо символа 'F' следует записать символ 'E'.) |
|
5 |
Спектральный диапазон (по волновым числам), используемый для вычислений, и число точек в спектре. Максимально допустимый спектральный диапазон составляет 1800 - 1480 см-1 при числе точек в спектре, равном 81. При задании диапазона и числа точек необходимо сохранять интервал между точками равным 4 см-1. |
|
6 - 14 |
ИК-спектр поглощения белка, выраженный в единицах л моль-1·см-1. |
|
17 |
Содержит единственный символ '*', положение которого определяет тип записи данных по аминокислотному составу белка: (а) NAmAc - указывается абсолютное количество остатков каждой аминокислоты в белке; (б) NAmAc/N - указывается абсолютное количество остатков каждой аминокислоты в белке, деленное на общее количество аминокислотных остатков. |
|
19 - 40 |
Аминокислотный состав белка. Здесь же отдельно указываются N - и C-концевые группы белка. |
|
42 |
Общее количество аминокислотных остатков в белке и значение pH, при котором снимался спектр. Указывать значение pH нужно обязательно, а общее количество аминокислотных остатков - только в том случае, если при записи аминокислотного состава белка записывались относительные доли аминокислотных остатков (вариант (б)). |
|
43 |
Комментарий к файлу |
Пример заполнения файла можно посмотреть в уже имеющемся файле SOURCE.
После подготовки файла SOURCE необходимо запустить вычисления. Для этого в командной строке следует ввести
STRUC SOURCE OUT.SVD OUT.CON и нажать кнопку [Enter]. (Названия файлов SOURCE, OUT.SVD и OUT.CON могут быть любыми, следует лишь соблюдать указанный порядок пр их записи.)
После окончания работы программ результаты вычислений моут быть просмотрены в файлах OUT.SVD и OUT.CON с помощью любого текстового редактора. Первая часть этих файлов содержит информацию о входных данных (взятую из файла SOURCE). Далее следует набор решений, соответствующий различным комбинациям ортогональных спектров (в файле OUT.SVD) или различным значениям параметра регуляризации (в файле OUT.CON). В конце файлов приводится аппроксимированный спектр и окончательно выбранное решение.
Можно просмотреть также промежуточные результаты вычислений программ. Файл PEPT, создаваемый программой AMACIR, содержит ИК-спектр поглощения пептидной цепи. Этот файл является входным для программ SVDIR и CONTIR. Файл AMACIR.RES, также создаваемый программой AMACIR, содержит данные об ионизации отдельных аминокислотных остатков при заданном значении pH, среднем значении массы одного аминокислотного звена данного белка, содержании в белке азота, а также три ИК-спектра поглощения: спектр белка (определенный экспериментально) и спектры боковых групп аминокислотных остатков и пептидной цепи (вычисленные программой AMACIR).
Для того, чтобы построить все три спектра на экране, необходимо запустить файл VISUAL.BAT.
В появляющемся после этого на экране главном меню программы PLOTNIK следует выбрать пункт Suit, позволяющий перейти в раздел задания параметров, необходимых для построения графиков. Ниже перечислены основные из них:
|
Titles/X Titles/Y Scale/X/Upper Scale/X/Lower Scale/Y/Upper Scale/Y/Lower Misc/Npts Misc/Data |
Волновое число, 1/см Коэффициент молярной экстинции, 1/ (моль см) 1480 1800 Auto Auto Auto Formatted |
Для одновременного построения трех графиков необходимо задать три набора данных (A, B и C) и указать имена файлов, содержащих эти данные:
|
Set |
Legend |
Filename |
|
A B C |
экспериментальный спектр спектр поглощения пептидной цепи спектр поглощения а/к остатков |
buf1.dat buf2.dat buf3.dat |
Файлы buf1.dat, buf2.dat и buf3.dat создаются программой PLOTFL на основе данных файла AMACIR.RES (эти файлы уничтожаются после завершения работы программы PLOTNIK). После задания параметров следует вернуться в главное меню программы PLOTNIK и выбрать в нем пункт View. При этом на экране будут построены требуемые графики.
Список литературы
1. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Том 2: Методы исследования структуры и функции биополимеров. М: Мир, 1984
2. Saxena V.P., Wetlaufer D.B. (1971) A new basis for interpreting the circular dichroic spectra of proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.68, 969-972
3. Сhang C.T., Wu C. -S.C., Yang J.T. (1978) Circular dichroic analysis of protein conformation: inclusion of the b-turns. Anal. Biochem.91, 13-31
4. Provencher S.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. (1981) Biochemistry 20, 33-37
5. Hennessey J.P., Jr., Johnson W.C., Jr. (1981) Information content in the circular dichroism of proteins. Biochemistry 20, 1085-1094
6. Compton L.A., Johnson W.C., Jr. (1986) Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication. Anal. Biochem.155, 155-167
7. Manavalan P., Johnson W.C., Jr. (1987) Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra. Anal. Biochem.167, 76-85
8. Venyaminov S.Yu., Kalnin N.N. (1990) Quantitative IR specrtophotometry of peptide compounds in water (H2O) solutions.I. Spectral parameters of amino acid residue absorption bands. Biopolymers 30, 1243-1257
9. Venyaminov S.Yu., Kalnin N.N. (1990) Quantitative IR specrtophotometry of peptide compounds in water (H2O) solutions. II. Amide absorption bands of polypeptides and fibrous proteins in a-, b-, and random coil conformations. Biopolymers 30, 1259-1271
10. Kalnin N.N., Baikalov I.A., Venyaminov S.Yu. (1990) Quantitative IR specrtophotometry of peptide compounds in water (H2O) solutions. III. Estimation of the protein secondary structure. Biopolymers 30, 1273-1280
