Р е а к ц и я н а п е р о к с и д а з у с б е н з и д и н о м . Метод основан на окислении бензидина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы с образованием продуктов, окрашенных вначале в голубовато-зеленый цвет, переходящий в буро-коричневый.
Порядок выполнения работы. Для проведения исследования используют вытяжку, приготовленную для проведения реакции с реактивом Несслера.
В пробирку наливают 2 мл вытяжки, прибавляют 5 капель 0,2 %-ного раствора бензидина, взбалтывают, после чего добавляют 2 капли 1 %-ного раствора пероксида водорода. Положительной реакцию считают тогда, когда после добавления пероксида водорода появляется голубовато-зеленое окрашивание раствора, переходящее в буро-коричневое, а отрицательной – при отсутствии окрашивания или появления буро-коричневого цвета вытяжки после 3 мин.
Свежее мясо дает положительную реакцию на пероксидазу, а несвежее – отрицательную.
О п р е д е л е н и е к и с л о т н о г о ч и с л а ж и р а. 20 г измельченной жировой ткани вытапливают на водяной бане. Полученный жир фильтруют через четыре слоя марли. К навеске жира (1 г), взвешенной с точностью до 0,001 г, добавляют 20 мл нейтральной смеси этилового эфира и этанола (соотношение 2:1), содержащей 5 капель 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое колбы тщательно взбалтывают, затем титруют 0,1 М водным раствором гидроксида калия до появления малиновой окраски, не исчезающей в течение 1 мин.
Кислотное число жира вычисляют по формуле:
x = 5,61VK/m0
где х – кислотное число жира, мг гидроксида калия, израсходованного на нейтрализацию свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира; 5,61 – количество гидроксида калия, содержащееся в 1 мл 0,1 М раствора, мг; V – объем 0,1 М раствора гидроксида калия, израсходованный на титрование, мл; К – коэффициент пересчета на точно 0,1 М раствор гидроксида калия; m0 – масса навески, г.
Расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 4 % средней величины. Результаты анализа сопоставляют с данными, приведенными в табл. 6.
Таблица 6
|
Жир |
Кислотное число жира, мг KOH |
|
|
свежего |
сомнительной свежести |
|
|
Охлажденные тушки |
||
|
Индюшиные |
До 1 |
1-3 |
О п р е д е л е н и е п е р о к с и д н о г о ч и с л а. навеску вытопленного жира (0,5 г), взятую с точностью 0,001 г, растворяют в 10 мл смеси ледяной уксусной кислоты и хлороформа (соотношение 1:1). К раствору добавляют 1 мл свежеприготовленного раствора йодида калия и выдерживают в темном месте в течение 5 мин. Затем к раствору добавляют 30 мл дистиллированной воды. Вы делившийся йод оттитровывают 0,002 М раствором тиосульфата натрия в присутствии крахмала до исчезновения синей окраски. Параллельно проводят контрольный опыт.
Пероксидное число определяют по формуле:
х = 0,000254 (V1-V2)K100/m0
где х – пероксидное число, 5 йода; 0,000254 – количество йода, эквивалентное 1 мл 0,001 м раствора тиосульфата натрия, г; V1 – объем 0,001 М раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование испытуемого раствора, мл; V2 – объем 0,002 м раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование контрольного раствора, мл; К – коэффициент пересчета на точно 0,002 м раствор тиосульфата натрия; m0 – масса навески, г.
Результаты анализа сопоставляют с данными, приведенными в табл. 7.
Таблица 7
|
Жир |
Пероксидное число жира, % йода |
|
|
свежего |
сомнительной свежести |
|
|
Охлажденные тушки |
||
|
Индюшиный |
До 0,01 |
0,01-0,1 |
Расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 0,1 % средней величины (4).
5. Определение карбонильных соединений.
5.1 Порча мяса.
Органолептические показатели могут указывать на степень развития автолитических процессов, происходящих при хранении, а также на свежесть, характер и глубину микробиологических процессов.
Гнилостная порча начинается на поверхности, а затем проникает в толщу мяса, причем скорость порчи зависит от температуры и влажности окружающей среды, состояния поверхности (корочка подсыхания, порезы) и гистологической структуры, вида бактерий, возбуждающих гнилостный распад.
Различные виды порчи взаимосвязаны. Ослизнение, протекающее при повышенных температурах и относительной влажности воздуха более 90%, сопровождается сплошным ростом бактерий. Плесени, развивающиеся в кислой среде, сдвигают рН в щелочную сторону и подготавливают условия для жизнедеятельности гнилостных микроорганизмов.
В результате развития гнилостной микрофлоры происходит распад белка с образованием как первичных, так и вторичных продуктов гидролиза, оказывающих существенное влияние на органолептические показатели и пищевую ценность мяса.
В глубоколежащих слоях мышц структура ядер, поперечная и продольная исчерченность хорошо выражены, окраска равномерная. Это свидетельствует о хорошей сохранности структур мышечной ткани и наличии условий, которые исключают возможность размножения гнилостной микрофлоры, сопровождающейся изменением микроструктуры мяса.
Изменение структуры ядер мышечных волокон свидетельствует о первоначальных признаках снижения качества мяса под воздействием ферментов развивающейся в его поверхностных слоях гнилостной микрофлоры и говорит о начавшемся процессе гнилостного разложения тканей мяса.
Микроструктурные изменения, характеризующие порчу мяса, распространяются на большую глубину, чем размножающаяся гнилостная микрофлора, что указывает на значительно опережающее проникновение в глубь мяса ферментов последней и имеет большое диагностическое значение при установлении границ порчи мяса.
В процессе переработки и хранения жировой ткани убойной птицы или выделенных из нее жиров под влиянием биологических и физико-химических факторов происходят разнообразные превращения. Контакт жировой ткани мяса с кислородом воздуха, водой, микроорганизмами, металлами и т.п. вызывает физико-химические и биологические процессы, изменяющие свойства жирового сырья и тканей мяса. Интенсивность изменений зависит как от свойств сырья, так и от условий хранения. Окислительные и гидролитические процессы могут вызвать порчу жиров (схема). В результате изменяется их химический состав, ухудшаются органолептические показатели и пищевая ценность. Процессы гидролиза и окисления часто протекают одновременно, усиливая изменения жира.
Схема
|
Порча жиров |
|
Окислительная |
|
Гидролитическая |
|
Жирные кислоты |
|
Глицерин |
|
Одно-, двузаме- щенные глицериды |
|
Пероксиды |
|
Прогоркание |
|
Осаливание |
|
Оксикислоты |
|
Газы |
|
Продукты конденсации |
|
Альдегиды |
|
Кетоны |
|
Низ. Жир. К. |
5.2 Определение карбонильных соединений
(альдегидов).
1) Качественные реакции на альдегиды.
Метод основан на способности альдегидов в кислой среде вступать в реакцию конденсации с многоатомными фенолами (флороглюцином, резорцином и др.), образуя окрашенные соединения.
Реакция с флороглюцином в эфире (по Крейсу). В пробирку помещают 3-5 г жира, расплавляют его на водяной бане, добавляют такие же объемы концентрированной соляной кислоты плотностью 1,19 г/см^3 и раствора флороглюцина в эфире массовой долей 1%. Пробирку закрывают резиновой пробкой и энергично встряхивают. При наличии альдегидов нижний слой в пробирке окрашивается в красный цвет.
Реакция с флороглюцином в ацетоне (по Видману). В пробирке расплавляют 3-5 г жира, добавляют к нему такой же объем раствора флороглюцина в ацетоне массовой долей 1% и 2-3 капли концентрированной серной кислоты, закрывают резиновой пробкой и встряхивают. При наличии альдегидов нижний слой содержимого в пробирке окрашивается в красный цвет.
Реакция с резорцином в бензоле (по Видману). К 3-5 г расплавленного в пробирке жира добавляют такие же объемы концентрированной серной кислоты и насыщенного раствора резорцина в бензоле. Пробирку закрывают резиновой пробкой и встряхивают. При наличии альдегидов появляется красно-фиолетовое окрашивание.
2) Количественное определение альдегидов основывается на измерении интенсивности окраски, развивающейся при взаимодействии альдегидов с бензидином
Результат определения условно выражают в виде бензидинового числа (Бч), показывающего содержание альдегидов в расчете на коричный альдегид в мг на 100 г жира.
Навеску жира массой 0,5-1,0 г (с точностью до 0,001 г) помещают в мерную колбу на 25 мл, растворяют в смеси этилового спирта с хлороформом (1:1) и доводят до метки. Полученный раствор наливают в кювету шириной 1 см и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 360 нм (светофильтр №2) по отношению к растворителю (спирт + хлороформ). Полученное значение оптической плотности характеризует окраску жира – D1.
Затем в колбу с притертой пробкой отбирают пипеткой с грушей 10 мл раствора жира, в другую колбу – 10 мл растворителя (хлороформ + спирт). В каждую колбу добавляют по 1 мл 0,5% раствора бензидина (в смеси 1:1 этилового спирта и ледяной уксусной кислоты), который готовят на один день.
