Определение уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб
МИНИСТЕРСТВО
УТВЕРЖДАЮ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И
ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
Заместитель руководителя
РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ
ВЕТЕРИНАРИИ
В.В. Селиверстов
107139, Москва, Орликов пер., 1/11
Для телеграмм: Москва, 84
Минсельхозпрод Телекс: 41773К ЛЕН
Телефоны: 975-58-50; 975-54-23
№ 13-4-2-/1795 от
25.11.99
МЕТОДИЧЕСКИЕ
УКАЗАНИЯ
ио определению уровня естественной
резистентности и оценке иммунного
статуса рыб
1. Общие положения
Естественная рсзистентность рыб -
это врожденная способность организма
противостоять агрессивному влиянию патогенных факторов биотической и
абиотической природы, в том числе, возбудителям инспекционных и инвазионных
болезней и продуктов их жизнедеятельности (экзо- и эндотоксинам). Иммунный
статус - это структурно-функциональное состояние иммунной системы в
конкретный момент жизни особи. Иммунная система рыб представляет собой
совокупность клеточных и гуморальных факторов иммунитета и состоит из клеток
лимфоидно-макрофагального комплекса (лимфоцитов, гранулоцитов, клеток
Купфера, Лангерганса и т.д.) и гуморальных компонентов (иммуноглобулины,
система компонентов комплемента, лизоцим, С-рсактивныс белки, интерферон,
лизины, гемолизины, гемагглютинины и т.п.). Клеточные элементы иммунной
системы организованы в тканевые и органные структуры. К ним относятся: тимус,
селезенка, печень, лимфоидная ткань головного и туловищного отделов почек,
скопления лимфоидной ткани черепной коробки, кишечника, перикарда,
Лейдигова и эпигональных органов. Лейдигов и эпигональные органы встречаются
только у хрящевых, а скопления лимфоидно-миелоидной ткани в черепной
коробке у хрящевых и костных ганоидов. Значительная часть
иммунокомпстентных клеток является составной частью крови и лимфы.
Иммунная система рыб отличается от таковой высших позвоночных отсутствием
лимфатических узлов, костного мозга и фабрициевой сумки (как это имеет место у
птиц); иммуноглобулины у рыб представлены, только igm подобными антителами,
тогда как у теплокровных - 5 классами (igg, igm, iga, igd, ige).
Для оценки естественной
резистентности организмов рыб к заразным
болезням, используют разнообразные методические приемы анализа структурно-
функционального состояния иммунной системы. Они основаны на регистрации
показателей специфических и неспецифичсских факторов клеточного и
гуморального иммунитета.
2. Неспецифические факторы
иммунитета Неспецифические факторы иммунитета участвуют в реализации функций защиты
организма рыб от чужеродных тел, независимо от специфических факторов, являются
естественными или врожденными компонентами организма рыб и не возникают вновь
при встрече с чужеродными телами. В зависимости от структурной организации их
компонентов подразделяются на клеточные и
гуморальные.
2.1. Клеточные факторы
В организме рыб они представлены
разнообразными по структурной
организации клетками: лейкоцитами, макрофагами, эндотелиоцитами и т.д. Одной
из основных функций этих клеток является (фагоцитоз. Кроме того, они участвуют
в синтезе медиаторов иммунного ответа и антибиотических веществ: лизоцима,
интерферона, агглютининов, интерлсйки-нов и др.
2.1.1. Лейкоциты
Лейкоциты рыб представлены
разнообразными по структуре и характеру
выполняемой функции клетками: лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами,
эозино- и базофилами. В основном, лейкоциты рыб, в отличие от высших
позвоночных, представлены лимфоцитами, тогда как у теплокровных - клетками
нейтрофильного ряда. У рыб на долю лимфоцитов приходится 45-99 % клеток от
общего числа лейкоцитов, а у высших позвоночных-25-30%. В 1 мл крови рыб
лейкоцитов содержится в 5-10 и более раз больше, чем у человека и животных.
Количество лейкоцитов и отдельных типов клеток, его составляющих, в организме
рыб колеблется и зависит от индивидуальных, возрастных особенностей, сезона
года, зараженности их паразитами, присутствия в воде токсических факторов и
условий содержания. На воздействие благоприятных и неблагоприятных факторов
рыбы реагируют интенсивностью лейкопоэза и изменением соотношения между
лимфоцитами и гранулоцитами. В организме рыб, подвергнутых воздействию
"агрессивных" факторов, увеличивается доля содержания клеток
гранулоцитарного ряда (палочкоядерных, ссг-ментоядерных нейтрофилов и
эозинофилов и аберрантных форм клеток).
Изменения в составе лейкоцитов
отражаются на степени сопротивляемости
рыб к инфекционным и инвазионным болезням. Снижение содержания
лимфоцитов отражается на интенсивности синтеза антител, отторжения
трансплантата, завершенности фагоцитоза и напряженности иммунитета к
болезням. Существуют прямой и непрямой способы учета общего числа
лейкоцитов в крови рыб. Исследования проводят в соответствии с
"Методическими указаниями по проведению гематологического обследования
рыб", утвержденными Департаментом ветеринарии 02.02.99 г., № 13-4-2/1738.
2.1.2. Фагоцитоз
Функциональное состояние фагоцитов
в большинстве случаев определяется
по фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови или клеток,
выделенных из головного, туловищного отделов почек и селезенки. Существуют
разнообразные методические приемы количественной оценки фагоцитарной
активности лейкоцитов. Одни основаны на подсчете числа фагоцитов с
захваченными чужеродными телами под микроскопом, другие - на регистрации
интенсивности проявления кислородзависимой антиинфекционной системы в
реакции хемилюминесцснции или по способности фагоцитов восстанавливать
растворимый краситель нитросиний тетразолий в нерастворимый диформазан
(НСТ-тест). Определение фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro и in vivo в
отношении микроорганизмов основано на учете фагоцитов под световым
микроскопом. Хсмилюминесцентный метод определения фагоцитарной
активности клеток требует специального дорогостоящего оборудования и
компьютерной техники. Способ определения фагоцитарной реакции лейкоцитов
по НСТ-тесту более трудоемкий, чем основанный на использовании тест-
микроорганизмов. Изучение фагоцитарной активности лейкоцитов в отношении
микробов в практике лабораторных исследований чаще всего проводится in vitro и
in vivo. В качестве тест-микробов рекомендуется использовать
грамположителъные и грамотри-цательные микробы: staphilococcus aureus,
acromonas hydrophila и saccharomyces cerevisiae.
2.1.2.1. Метод определения фагоцитарной
активности лейкоцитов in vitro по
Е.А. Коста и М.И. Стенко (1947).
Принцип метода. Указанный метод
основан на учете соотношения числа
лейкоцитов, участвующих в фагоцитозе, и общего числа клеток белой крови.
- Оборудование и реактивы: пробирки стерильные; пипетки стерильные на
1,0 мл; пастеровские пипетки стерильные; 0,65%-ный стерильный раствор натрия
хлорида; 2%-ный стерильный раствор натрия цитрата; водяная баня,
отрегулированная на 60°С; объект фагоцитоза -одномиллиардная взвесь суточной
культуры бактерий a. hydrophila, инактивированных при 60°С в течение 30 минут,
приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат
отрегулированный на 26°С; предметные стекла; шли4юваннос стекло; набор для
окраски мазков крови; метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром ]: 1;
рабочий раствор красителя азур-эозина; иммерсионное масло;
микроскоп.
- Материал для исследования, ход определения и учет результатов. В
пробирку вносят 0,1 мл 2%-ного стерильного раствора натрия цитрата, (,|,2 мл
свсжевзятой крови от обследуемой рыбы, 0,2 мл объекта фагоцитоза. Взвесь
осторожно, но тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре
26°С (для теплолюбивых рыб) и более низкой (для холодолюбивых). Через 15 и 30
минут, 1; 1,5 и 2 часа с момента тер-мостатирования пастеровской пипеткой
забирают смесь из пробирки, помещают на предметное стекло и делают мазки,
которые фиксируют в течение 10 мин. смесью спирта с эфиром (1:1) или в течение
5 мин. метиловым спиртом. Затем мазки красят в течение 20-40 мин. рабочим рас-
твором азур-эозина. После этого их просматривают под иммерсией (ок.7.x об.90).
Подсчитывают 100 (иногда 50) лейкоцитов. Захватывающую способность
лейкоцитов выражают двумя показателями: процентом фагоцитоза - процентным
отношением лейкоцитов, захвативших тест-микробы, к общему числу
подсчитанных, и фагоцитарным индексом - количеством тест-микробов,
захваченных одним фагоцитирующим лейкоцитом.
2.1.2.2. Метод определения
фагоцитарной активности лейкоцитов in vivo по
Г.Д.Гончарову (1966)
- Принцип метода заключается в исследовании реакции фагоцитоза
лейкоцитов в брюшной полости рыб. Анализ фагоцитарной реакции, проводится
через 15, 30, 60, 90 и 120 мин, с момента введения микроорганизмов
- Оборудование и реактивы: шприц и инъекционные иглы; 0.65%-ный
стерильный раствор натрия хлорида; водяная баня, отрегулированная на 60°С;
одномиллиардная взвесь суточной культуры бактерий А. hydrophila,
инактивированной при 60°С в течение 30 мин.; термостат, отрегулированный на
26°С; пастеровские пипетки стерильные; предметные стекла; шлифованное стекло;
метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром 1:1; рабочий раствор азур-
эозина; иммерсионное масло; микроскоп.
