Определение уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб

3.2.2.2. Реакция агглютинации латекс-антигена (или антител) - РА-ЛАг
(Зингер, Плотц, 1956).

Принцип метода. Реакция агглютинации мслкодисперсных частиц латекса,
нагруженных: антигеном (АГ), под воздействием специфических антител (at)
иммунной сыворотки или антителами, при взаимодействии с гомологичным АГ,
применяется для обнаружения содержания антител у иммунных рыб к разным АГ
и диагностики возбудителя болезни.

Компоненты и материалы. at - 5%-ный раствор растворимого антигена (в
качестве источника АГ могут служить гомогенаты аутоантигс-нов, возбудителей
болезни, вакцины, сыворотки крови и т.д.). Исследуемая сыворотка рыб. 10%-ная
суспензия частиц полистиролового латекса стандартной величины-от 0,77 до 0,81
мкм на 0.65% растворе nacl. Хранят при 2-4° С, но не дольше 4-х недель.
Разбавители: боратныи или глициновый буфер с рН 8,1-8,3. Боратный буфер: 50
мл 0,1 М раствора борной кислоты (6,184 г НзВОз растворяют в 1000 мл диет.
воды), 5,9 мл 0,1%-ного раствора naoh и 100 мл 0,85%-ного раствора хлорида
натрия. Глициновый буфер: к 1 л 0,1 М раствора глицина, доведенного до рН 8,2 с
помощью 1 н. раствора naoh, добавляют 10 г nacl. Материалы:
пипетки, пробирки, колбы и др.

Техника постановки реакции. Дм сенсибилизации частиц латекса к 0,1 мл
10%-ной суспензии мслкодиспсрсных частиц добавляют 0,5 мл 5%-ного раствора
АГ и 9,4 мл боратного буфера. Суспензию тщательно перемешивают и
выдерживают 2 ч при 26°С. Постановку реакции латскс-аплютинации начинают с
приготовления в дополнительном ряду пробирок разведении сыворотки
исследуемых рыб на боратном буфере в соотношениях от 1:10, 1:20 до 1:1280-
1:2560.

Капельная реакция латекс-агглютинации. В ряд микропробирок вносят по 2
капли соответствующих разведении исследуемой сыворотки и добавляют по 1
капле суспензии частиц латекса, сенсибилизированных соответствующим АГ. В
контроле смешивают аналогичные объемы частиц латекса с разведсниями
инактивированной нормальной сыворотки. Штатив с пробирками встряхивают и
выдерживают при 26° С 30 мин. Затем смеси центрифугируют при 1500 об/мин в
течение 3 мин, осторожно встряхивают н учитывают результат реакции.

Пробирочная реакция латекс-агглютинации. В опытный ряд пробирок
приливают по 1 мл соответствующих разведении исследуемой сыворотки и
добавляют по 1 мл латскс-АГ. Контрольные смеси: 1) борат-ньш буфср+суспснзия
латекс-АГ; 2) разведения нормальной сыворотки + суспензия латекс-АГ. Пробирки
встряхивают, помещают в водяную баню при 26°С на 2 ч, центрифугируют при
1500 об/мин в течение 10 мин, осторожно встряхивают и учитывают результат
реакции.

Учет и оценка результатов реакции производятся по образованию зерен
латсксного агглютината и просветлению жидкости в пробирке. Учет результатов
целесообразнее проводить в агглютиноскопе; оценка проводится по 4-балльной
системе.

4. Определение напряженности иммунитета

Под напряженностью иммунитета следует понимать способность организма
рыб противостоять агрессивному влиянию возбудителей болезни и их продуктам
метаболизма и распада (экзо- или эндотоксинам). Напряженность иммунитета
отражает совокупную деятельность всех функциональных структур иммунной
системы рыб на уровне целостного организма.
Одним из объективных способов оценки напряженности иммунитета или
устойчивости рыб к паразитам, вызывающим инфекционные и инвазионные
болезни, является заражение рыб патогенными организмами или их токсинами.
Оценка напряженности иммунитета применяется в селекционной работе, при
определении эффективности вакцинации, последствий влияния благоприятных и
неблагоприятных для жизнедеятельности биотических и абитических (включая
токсические) факторов на выживаемость рыб.

4.1. Методика определения напряженности иммунитета (с ис-
пользованием a.hydrophila)

4.1.1. Принцип метода основан на экспериментальном заражении рыб
вирулентной культурой, вызывающей 50% или 10()%-нуто гибель исследуемого
вида рыб. Причем, в группе рыб с низким уровнем естественной резистентности
ld5o меньше, чем в группе рыб с более высоким уровнем напряженности
естественного иммунитета.

4.1.2. Оборудование и реактивы: аквариумы, пробирки, шприцы, рыба,
суточная культура вирулентных бактерий - возбудителя инфекционной болезни
рыб.

4.1.3. Материал для исследования, ход определения и учет результатов.
Отбирают 60 экз. рыб, имеющих средний для данной партии рыб показатель
навески. В заполненные водой (с температурой не ниже 18°С и не выше 26° С)
пять (и более) аквариумов или бассейнов с аэрацией или садки, установленные в
карантинном пруду, помещают по 25 экз. (из расчета не более 5 г ихтиомассы на 1
л воды) отобранных рыб, которым предварительно вводят внутрибрюшинно
одномиллиардную взвесь суточной вирулентной культуры бактерий a. hydrophila,
приготовленную на 0.65%-ном стерильном растворе натрия хлорида в дозах 0.125;
0.25; 0.5; 0.75; 1 мл (и более). Наблюдение за инфицированной рыбой ведут в
течение 10 суток с момента инъекции микробной взвеси и по вьккивае-мости
устанавливают дозу инфекта, вызывающую 50 или 100%-ную гибель рыб, с
характерными для данной инспекции клиническими и патоло-гоанатомическими
изменениями. Расчет летальной дозы, вызывающей 50%-ную гибель рыб (ld5o),
проводят по методу Рида и Менча (Гончаров, 1973).
Расчитанной дозой ld50 инфекта проводят заражение по 25 экз. исследуемых
рыб, относящихся к одному виду, возрасту, с одинаковой массой, но находящихся
при разных условиях содержания, либо на разных этапах иммуногеиеза, течения
болезни и т.д. Постановку и проведение опыта, а также учет результатов
осуществляют так же, как и при отработке дозы ld5o. Напряженность иммунитета
определяют с учетом процента погибших рыб в опытной группе в сравнении с
контролем.
По окончании аквариумных опытов проводят обеззараживание воды в
аквариумах путем создания в них 10%-ной концентрации формалина или 10%-
ного раствора хлорной извести. Через час воду спускают в канализационную сеть,
а рыб сжигают. Весь инвентарь и посуду, бывшие в употреблении при работе с
больной рыбой, дезинфицируют в 10%-ном растворе формалина в течение часа.
При завершении биологической пробы в бетонированных бассейнах,
земляных садках, карантинных прудах рыбу сжигают и проводят дезинфекцию
воды пугем хлорирования, доводя содержание свободного хлора в воде до 4-5
мг/л. Сутки спустя воду пропускают через известковый фильтр (используют
только свежую негашеную известь). После этого проводят дезинфекцию ложа
прудов или садков и бассейнов негашеной или хлорной известью и оставляют их
без воды на срок не менее месяца. С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу Методические указания по определению уровней естественной резистентности организма рыб (к инфекционным болезням)", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 13.07.87 №432-3.

Приложение 1
к Методическим указаниям по определению уровня
естественной резистентности и оценке
иммунного статуса рыб, утв. 25 ноября 1999 г.


Уровень фагоцитарной активности лейкоцитов карпа на стадии
поглощения, %

Возраст рыб, время фагоцитоза с момен- та термостатирова-ния или введения

Объекта фагоцитоза 

Низкий

Средний

Высокий

Процент фагоцитоза

Фагоцитарный индекс

Процент фагоцитоза

Фагоцитарный индекс

Процент фагоцитоза

Фаго-цитар-ный индекс

сеголетки
 
 
 
 
 
 
 
 


15 мин.

6,0+2,0

-

8,0+2,0

-

10 и

более

-

30 мин.

7,0+2,0

0,3+0,2

9,0+2,0

0,6+0,2

11-"-

0,7 и более

1 час

17,0+4,0

0,8±0,2

21,0+4,0

0,1+0,2

25 -"-

1,2-"-

1,5 часа

24,0+5,0

1,3+0,2

29,0+5,0

1,5+0,2

34 -"-

1.7-"-

2 часа

19,0+5,0

1,4+0,2

24,0+5,0

1,6+0,2

29 -"-

1,8-"-

двухлетки
 
 
 
 
 
 


15 мин.

9.0+3,0


12,0+3,0

-

15 -"-

-

30 мин.

13,0+5,0

0,3+0,2

18,0+5,0

0,5+0,2

23 -"-

0,7 -"-

1 час

20,0+7,0

0.9+0,2

27,0+7,0

1,1+0,2

34 -"-

1,3-"-

1,5 часа

28,0+8,0

1,3+0,2

36,0+6,0

1,5+0,2

44.-"-

1,7-"-

2 часа

27.0+8,0

1,4+0,2

35,0+8,0

1,6+0,2

43 -"-

1,8-"-

трехлетки
 
 
 
 
 
 
 
 


15 мин.

9,0+3,0


12,0+3,0

-

15-"-

-

30 мин.

14,0+5,0

0,4+0,2

19,0+5,0

0,6+0,2

24 -"-

0,8 -"-

1 час

24,0+6,0

1,0+0,2

30,0+6,0

1,2+0,2

36 -"-

1,4-"-

1,5 часа

30,0+s,0

1,2+0,4

38,0+8,0

1,6+0,4

46 -"-

2,0 -"-

2 часа

28.0+8.0

1,4+0,3

36,0+8,0

1,7+0,3

44 -"-

2,0 -"-

4-8-летки
 
 
 
 
 
 
 
 


1 5 мин.

10,0+5,0


15,0+5,0

-

20 -".-

-

30 мин.

15,0+5,0

0,4+0,2

20,0+5,0

0,6+0,2

25 -"-

0,8 -"-

1 час

22,0+8,0

1,2+0,2

32,0+8,0

1,2+0,2

40 -"-

1,4-"-

1,5 часа

30,0+9,0

1,2+0-4

39,0+9,0

1,6+0,4

48 -"-

2,0 -"-

2 часа

29,0+9,0

1,4+0,3

38,0+9,0

1,7+0,3

47 -"-

2,0-"-



Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6



Реклама
В соцсетях
рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать