3.2.2.2. Реакция агглютинации
латекс-антигена (или антител) - РА-ЛАг
(Зингер, Плотц, 1956).
Принцип метода. Реакция
агглютинации мслкодисперсных частиц латекса,
нагруженных: антигеном (АГ), под воздействием специфических антител (at)
иммунной сыворотки или антителами, при взаимодействии с гомологичным АГ,
применяется для обнаружения содержания антител у иммунных рыб к разным АГ
и диагностики возбудителя болезни.
Компоненты и материалы. at - 5%-ный
раствор растворимого антигена (в
качестве источника АГ могут служить гомогенаты аутоантигс-нов, возбудителей
болезни, вакцины, сыворотки крови и т.д.). Исследуемая сыворотка рыб. 10%-ная
суспензия частиц полистиролового латекса стандартной величины-от 0,77 до 0,81
мкм на 0.65% растворе nacl. Хранят при 2-4° С, но не дольше 4-х недель.
Разбавители: боратныи или глициновый буфер с рН 8,1-8,3. Боратный буфер: 50
мл 0,1 М раствора борной кислоты (6,184 г НзВОз растворяют в 1000 мл диет.
воды), 5,9 мл 0,1%-ного раствора naoh и 100 мл 0,85%-ного раствора хлорида
натрия. Глициновый буфер: к 1 л 0,1 М раствора глицина, доведенного до рН 8,2 с
помощью 1 н. раствора naoh, добавляют 10 г nacl. Материалы:
пипетки, пробирки, колбы и др.
Техника постановки реакции. Дм
сенсибилизации частиц латекса к 0,1 мл
10%-ной суспензии мслкодиспсрсных частиц добавляют 0,5 мл 5%-ного раствора
АГ и 9,4 мл боратного буфера. Суспензию тщательно перемешивают и
выдерживают 2 ч при 26°С. Постановку реакции латскс-аплютинации начинают с
приготовления в дополнительном ряду пробирок разведении сыворотки
исследуемых рыб на боратном буфере в соотношениях от 1:10, 1:20 до 1:1280-
1:2560.
Капельная реакция
латекс-агглютинации. В ряд микропробирок вносят по 2
капли соответствующих разведении исследуемой сыворотки и добавляют по 1
капле суспензии частиц латекса, сенсибилизированных соответствующим АГ. В
контроле смешивают аналогичные объемы частиц латекса с разведсниями
инактивированной нормальной сыворотки. Штатив с пробирками встряхивают и
выдерживают при 26° С 30 мин. Затем смеси центрифугируют при 1500 об/мин в
течение 3 мин, осторожно встряхивают н учитывают результат реакции.
Пробирочная реакция
латекс-агглютинации. В опытный ряд пробирок
приливают по 1 мл соответствующих разведении исследуемой сыворотки и
добавляют по 1 мл латскс-АГ. Контрольные смеси: 1) борат-ньш буфср+суспснзия
латекс-АГ; 2) разведения нормальной сыворотки + суспензия латекс-АГ. Пробирки
встряхивают, помещают в водяную баню при 26°С на 2 ч, центрифугируют при
1500 об/мин в течение 10 мин, осторожно встряхивают и учитывают результат
реакции.
Учет и оценка результатов реакции
производятся по образованию зерен
латсксного агглютината и просветлению жидкости в пробирке. Учет результатов
целесообразнее проводить в агглютиноскопе; оценка проводится по 4-балльной
системе.
4. Определение напряженности иммунитета
Под напряженностью иммунитета
следует понимать способность организма
рыб противостоять агрессивному влиянию возбудителей болезни и их продуктам
метаболизма и распада (экзо- или эндотоксинам). Напряженность иммунитета
отражает совокупную деятельность всех функциональных структур иммунной
системы рыб на уровне целостного организма.
Одним из объективных способов оценки напряженности иммунитета или
устойчивости рыб к паразитам, вызывающим инфекционные и инвазионные
болезни, является заражение рыб патогенными организмами или их токсинами.
Оценка напряженности иммунитета применяется в селекционной работе, при
определении эффективности вакцинации, последствий влияния благоприятных и
неблагоприятных для жизнедеятельности биотических и абитических (включая
токсические) факторов на выживаемость рыб.
4.1. Методика определения
напряженности иммунитета (с ис-
пользованием a.hydrophila)
4.1.1. Принцип метода основан на
экспериментальном заражении рыб
вирулентной культурой, вызывающей 50% или 10()%-нуто гибель исследуемого
вида рыб. Причем, в группе рыб с низким уровнем естественной резистентности
ld5o меньше, чем в группе рыб с более высоким уровнем напряженности
естественного иммунитета.
4.1.2. Оборудование и реактивы:
аквариумы, пробирки, шприцы, рыба,
суточная культура вирулентных бактерий - возбудителя инфекционной болезни
рыб.
4.1.3. Материал для исследования,
ход определения и учет результатов.
Отбирают 60 экз. рыб, имеющих средний для данной партии рыб показатель
навески. В заполненные водой (с температурой не ниже 18°С и не выше 26° С)
пять (и более) аквариумов или бассейнов с аэрацией или садки, установленные в
карантинном пруду, помещают по 25 экз. (из расчета не более 5 г ихтиомассы на 1
л воды) отобранных рыб, которым предварительно вводят внутрибрюшинно
одномиллиардную взвесь суточной вирулентной культуры бактерий a. hydrophila,
приготовленную на 0.65%-ном стерильном растворе натрия хлорида в дозах 0.125;
0.25; 0.5; 0.75; 1 мл (и более). Наблюдение за инфицированной рыбой ведут в
течение 10 суток с момента инъекции микробной взвеси и по вьккивае-мости
устанавливают дозу инфекта, вызывающую 50 или 100%-ную гибель рыб, с
характерными для данной инспекции клиническими и патоло-гоанатомическими
изменениями. Расчет летальной дозы, вызывающей 50%-ную гибель рыб (ld5o),
проводят по методу Рида и Менча (Гончаров, 1973).
Расчитанной дозой ld50 инфекта проводят заражение по 25 экз. исследуемых
рыб, относящихся к одному виду, возрасту, с одинаковой массой, но находящихся
при разных условиях содержания, либо на разных этапах иммуногеиеза, течения
болезни и т.д. Постановку и проведение опыта, а также учет результатов
осуществляют так же, как и при отработке дозы ld5o. Напряженность иммунитета
определяют с учетом процента погибших рыб в опытной группе в сравнении с
контролем.
По окончании аквариумных опытов проводят обеззараживание воды в
аквариумах путем создания в них 10%-ной концентрации формалина или 10%-
ного раствора хлорной извести. Через час воду спускают в канализационную сеть,
а рыб сжигают. Весь инвентарь и посуду, бывшие в употреблении при работе с
больной рыбой, дезинфицируют в 10%-ном растворе формалина в течение часа.
При завершении биологической пробы в бетонированных бассейнах,
земляных садках, карантинных прудах рыбу сжигают и проводят дезинфекцию
воды пугем хлорирования, доводя содержание свободного хлора в воде до 4-5
мг/л. Сутки спустя воду пропускают через известковый фильтр (используют
только свежую негашеную известь). После этого проводят дезинфекцию ложа
прудов или садков и бассейнов негашеной или хлорной известью и оставляют их
без воды на срок не менее месяца. С утверждением настоящих Методических
указаний утрачивают силу Методические указания по определению уровней
естественной резистентности организма рыб (к инфекционным болезням)", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР
13.07.87 №432-3.
Приложение 1
к Методическим указаниям по определению уровня
естественной резистентности и оценке
иммунного статуса рыб, утв. 25 ноября 1999 г.
Уровень фагоцитарной активности лейкоцитов карпа на стадии
поглощения, %
|
Возраст рыб, время фагоцитоза с момен- та термостатирова-ния или введения Объекта фагоцитоза |
Низкий |
Средний |
Высокий |
||||
|
Процент фагоцитоза |
Фагоцитарный индекс |
Процент фагоцитоза |
Фагоцитарный индекс |
Процент фагоцитоза |
Фаго-цитар-ный индекс |
||
|
сеголетки |
15 мин. |
6,0+2,0 |
- |
8,0+2,0 |
- |
10 и более |
- |
|
30 мин. |
7,0+2,0 |
0,3+0,2 |
9,0+2,0 |
0,6+0,2 |
11-"- |
0,7 и более |
|
|
1 час |
17,0+4,0 |
0,8±0,2 |
21,0+4,0 |
0,1+0,2 |
25 -"- |
1,2-"- |
|
|
1,5 часа |
24,0+5,0 |
1,3+0,2 |
29,0+5,0 |
1,5+0,2 |
34 -"- |
1.7-"- |
|
|
2 часа |
19,0+5,0 |
1,4+0,2 |
24,0+5,0 |
1,6+0,2 |
29 -"- |
1,8-"- |
|
|
двухлетки |
15 мин. |
9.0+3,0 |
|
12,0+3,0 |
- |
15 -"- |
- |
|
30 мин. |
13,0+5,0 |
0,3+0,2 |
18,0+5,0 |
0,5+0,2 |
23 -"- |
0,7 -"- |
|
|
1 час |
20,0+7,0 |
0.9+0,2 |
27,0+7,0 |
1,1+0,2 |
34 -"- |
1,3-"- |
|
|
1,5 часа |
28,0+8,0 |
1,3+0,2 |
36,0+6,0 |
1,5+0,2 |
44.-"- |
1,7-"- |
|
|
2 часа |
27.0+8,0 |
1,4+0,2 |
35,0+8,0 |
1,6+0,2 |
43 -"- |
1,8-"- |
|
|
трехлетки |
15 мин. |
9,0+3,0 |
|
12,0+3,0 |
- |
15-"- |
- |
|
30 мин. |
14,0+5,0 |
0,4+0,2 |
19,0+5,0 |
0,6+0,2 |
24 -"- |
0,8 -"- |
|
|
1 час |
24,0+6,0 |
1,0+0,2 |
30,0+6,0 |
1,2+0,2 |
36 -"- |
1,4-"- |
|
|
1,5 часа |
30,0+s,0 |
1,2+0,4 |
38,0+8,0 |
1,6+0,4 |
46 -"- |
2,0 -"- |
|
|
2 часа |
28.0+8.0 |
1,4+0,3 |
36,0+8,0 |
1,7+0,3 |
44 -"- |
2,0 -"- |
|
|
4-8-летки |
1 5 мин. |
10,0+5,0 |
|
15,0+5,0 |
- |
20 -".- |
- |
|
30 мин. |
15,0+5,0 |
0,4+0,2 |
20,0+5,0 |
0,6+0,2 |
25 -"- |
0,8 -"- |
|
|
1 час |
22,0+8,0 |
1,2+0,2 |
32,0+8,0 |
1,2+0,2 |
40 -"- |
1,4-"- |
|
|
1,5 часа |
30,0+9,0 |
1,2+0-4 |
39,0+9,0 |
1,6+0,4 |
48 -"- |
2,0 -"- |
|
|
2 часа |
29,0+9,0 |
1,4+0,3 |
38,0+9,0 |
1,7+0,3 |
47 -"- |
2,0-"- |
|
