Глутатион-S-трансфераза входит в семейство ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их коньюгации с восстановленным глутатионом, GST локализованы преимущественно в цитозоле клеток. Основная функция GST-защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона или нуклеофильного замещения гидрофобных групп:
ROOH + 2GSH → ROH + GSSG + H2O
R + GSH → HRSG
RX + GSH → RSG + HX
GST способны восстанавливать гидроперокси-группы окисленных фосфолипидов непосредственно в мембранах без их предварительного фосфолипидного гидролиза свободными жирными кислотами. Этот фермент конъюгирует с GSН токсичные продукты ПОЛ (ноненали, децинали, холестерин-α-оксид) и тем способствуют их выведению из организма. Таким образом, GST является важным компонентом антиоксидантной защиты, особенно от эндогенных метаболитов, образующих при окислительном стрессе [Владимиров, 1998].
Глутатионредуктаза. Во многих реакциях, катализируемых GPO и GST, две молекулы GST соединяются дисульфидной связью и образуют окисленный глутатион. Для восстановления GSSG в клетках существует специальный фермент – глутатионредуктаза [Зенков, Меньщикова, 2004].
ГР широко распространенный флавиновый фермент, поддерживающий высокую внутриклеточную концентрацию GSH, катализируя обратимое NFDFH– зависимое восстановление GSSG с образованием двух молекул GSH.
GSSG + NADFH + H+ → 2GSH + NADF+
ГР содержится в основном в растворимой части клетки.
Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа. Для восстановления окисленного глутатиона ГР в качестве донара водорода используется NADFH, который образуется в пентозофосфатном пути в ходе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции [Андреев, 1999]
G6FD – фермент, катализирующий начальную реакцию пентозофосфатного пути: восстановление глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконат. Она состоит из двух типов субъединиц, которые состоят из 479 аминокислотных остатков, имеют один и тот же СООН - концевой участок, но разные NH2-концы, Эти субъединицы различаются по длине и последовательности аминокислот. Реакцию, катализируемую G6FD, с кинетической точки зрения можно рассматривать как двухсубстратную реакцию, протекающую с участием субстрата и кофермента, выполняющего роль второго субстрата. Фермент очень сильно ингибируется NADFH и ATF, по типу конкурентного ингиирования.
Глутатион – трипептид (L-γ-глутамил-L-цистеинилглицин), который при физиологических значениях рН имеет две отрицательно заряженные карбоксильные группы и положительно заряженную аминогруппу.
Наличие γ-глутамильной связи защищает трипептид от деградации внутриклеточными пептидазами, а сульфгидрильная группа цистеина может служить донором электронов, придавая глутатиону свойства восстановителя и способность удалять свободные радикалы. Одноэлектронная реакция GSH со свободными радикалами приводит к образованию тиильного радикала GS., который при димеризации с другим GS. радикалом дает дисульфид глутатиона (GSSG). Второй тип окислительно-восстановительных реакций, в которых принимает участие глутатион - это реакции тиол-дисульфидного обмена [Brune,1995]. При окислительно-восстановительных реакциях третьего типа происходит двухэлектронное окисление с образованием интермедиата, который затем реагирует со второй молекулой, идентичной первой или отличной от нее. При этом в первом случае образуется GSSG, а во втором-смешанный дисульфид.
В клетках всех типов GSH синтезируется в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеинсинтетазой (γ-GCS) и GSН-синтетазой (GS). γ-GCS катализирует образование пептидной связи между γ-карбоксильной группой глутамата и α-аминогруппой цистеина. Глутатионсинтетаза образует пептидную связь между α-карбоксильной группой цистеина в составе γ-глутамилцистеина и α-аминогруппой глицина. Обе реакции являются ATF-зависимыми, имеют сходный каталитический механизм и протекают через образование ацилфосфатного интетрмедиата [Davies,1995].
Статус глутатиона определяется как общая концентрация глутатиона и количественное соотношение между различными формами, в которых он существует в клетке. Статус глутатиона обусловлен динамическим равновесием между реакциями синтеза, деградации, транспорта, окисления и восстановления и поэтому может изменяться в зависимости от преобладания тех или иных реакций, что определяется состоянием клетки и окружающей среды. Изменение статуса GSH может наблюдаться как при нормальных физиологических ситуациях, так и при стрессах. Для ингибирования синтеза GSH у эукариот широко используется ингибитор γ-глутамилцистиинсинтетазы [Gebhardt,1984].
Редокс-активность глутатиона при одновременной его устойчивости к окислению кислородом, высокая концентрация и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают GSH важнейшим внутриклеточным редокс-буфером. Редокс система глутатиона включает в себя сам глутатион, GPO и ГSТ [Davies,1995].
GSH реагирует с очень большим числом электрофильных компонентов с образованием GSH-конъюгатов. Эта реакция может происходить спонтанно или катализироваться ферментами GSТ, затем коньюгаты деградируют до относительно безвредных меркаптуровых кислот. Глутатион также участвует в детоксикации некоторых реактивных альдегидов, которые могут образовываться при окислительных процессах в клетках. У эукариот глутатион играет ключевую роль в защите от окислительного стресса как кофактор селенозависимых и независимых GPO (Рис. 2). При окислительном стрессе идет интенсивное окисление GSH, и снижение соотношения GSH/GSSG является одним из основных признаков окислительного стресса в клетках [Brune,1995].
Защита живых организмов от окислительных повреждений не ограничивается рассмотренными выше антиоксидантными системами, а осуществляется так же большим количеством репарационных систем, специфическими протеолитическими ферментами; макрофагами и гепатоцитами, эффективно захватывающими окисленные липопротеины через специальные «скэвенджнр-рецепторы». Эта еще раз свидетельствует о важности и сложности окислительных процессов с участием АФК, протекающих в живом организме.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
Объектом исследования явились эритроциты крови практически здоровых людей, проживающих в Советском и Октябрьском районах г. Красноярска, а так же эритроциты крови людей с ЛОР-патологиями.
Всего обследовано 131 человек в возрасте от 18 до 54 лет, забор материала исследования проводился в клиническо-диагностической лаборатории ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН. Группу контроля составили 102 практически здоровых человека, неболевших острыми респираторными заболеваниями в течение последнего месяца и не имеющих хронических ЛОР-заболеваний. Здоровые люди были отобраны в 2-х районах города Красноярска ЛОР-врачом по данным клинического осмотра. Группа людей с ЛОР-заболеваниями составила 29 человек, проживающих в различных районах г. Красноярска.
Таблица 1
Характеристика материала исследования и объёма проведенных работ
Методы исследования
Здоровые
ЛОР-больные
Всего
Определение содержания GSH в эритроцитах крови
Определение активности GPO в эритроцитах крови
Определение активности GST в эритроцитах крови
Определение активности GR в эритроцитах крови
Определение содержания гемоглобина в эритроцитах крови
91
89
90
67
91
29
20
28
6
29
120
109
118
73
120
Всего
428
112
540
Определение активности глутатионзависимых ферментов – GPO, GST и GR, а так же содержание GSH проводили в упакованных эритроцитах крови (табл. 1).
2.2. Приготовление эритроцитов
Гепаринизированную кровь центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин. (1700g). После центрифугирования убирают слой плазмы и тонкую белую лейкоцитарную пленку. Плазму отбирают отдельно и сохраняют. Оставшуюся после отбора плазмы эритроцитарную массу трижды отмывают физиологическим раствором (0,9%-ным NaCl) и центрифугируют по 15 минут при 3000 об/мин. (1700g). Супернатант отбрасывают. Последнее центрифугирование проводят в течение 20 минут для более плотной упаковки клеток [Авраамова, Титова, 1978].
2.3. Определение содержание гемоглобина
Содержание Hb определяют унифицированным гемиглобинцианидным методом с использованием набора реактивов фирмы “Агат-Мед”.
Принцип метода заключается в следующем: Hb крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в Met-Hb, образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), оптическая плотность которого при 540 нм пропорциональна концентрации Hb в образце крови [Меньшиков, 1987]. Содержание Hb в опытных образцах выражали в граммах на литр упакованных эритроцитов.
Реактивы:
1. Трансформирующий реагент – сухая смесь натрий углекислый кислый, 1,0г, калий железосинеродистый, 200 мг.
2. Ацетонциангидрин.
3. Калибровочный раствор гемоглобин с концентрацией 120 г/л.
Ход определения
К 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз) или гемолизата, хорошо перемешивают. Определение проводят через 10 минут против холостой пробы (трансформирующего раствора), окраска устойчива в течение не менее 1 часа.
При использовании фотоколориметра определение проводят в диапазоне длин волн 500-560 нм (зелёный светофильтр). Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывают также, как и пробу цельной крови. Расчёт содержания гемоглобина производят по формуле:
,
где:
Hb – содержание гемоглобина в опытной пробе, г/л;
Dо – оптическая плотность опытной пробы;
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
