Dx – оптическая плотность калибровочной пробы;
120 – содержание гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.
2.4. Определение количества восстановленного глутатиона
Принцип метода основан на взаимодействии GSH с ДТНБК (5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм [Beutler, 1990].
Ход определения
Готовим гемолизат добавлением 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дист. Н2О, охлаждённой до 0ºС. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл осаждающего раствора. Пробы тщательно перемешивали и после 20 минутного стояния при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. 1 мл фильтрата помещали в спектрофотометрическую кювету объёмом 3 мл, добавляли 4 мл фосфатного буфера. Затем в пробу вносили 500 мкл раствора ДТНБК. Сразу же после перемешивания должна появиться жёлтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с ДТНБК. Пробу фотометрировали при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Поскольку раствор ДТНБК имеет слабожелтую окраску, параллельно с опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий раствор, разведённый дист. Н2О в отношении 2:5.
Реактивы:
1. Осаждающий раствор: 1,67 г ледяной ортофосфорной кислоты, 0,2 г ЭДТА и 30 г хлористого натрия растворяли в дист. Н2О и доводили до метки 100 мл.
2. Фосфатный буфер: 0,3 М Na2HPO4
3. ДТНБК: 0,02%-ный раствор, приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия
Содержание восстановленного глутатиона рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК и выражали в мкмоль на грамм Hb.
Содержание глутатиона рассчитывают по формуле:
,
где:
С – концентрация восстановленного глутатиона, мкмоль/г Hb;
Е1 – оптическая плотность опытной пробы до добавления ДТНБК;
Е2 – оптическая плотность опытной пробы после добавления ДТНБК;
138 – разведение эритроцитов в реакционной пробе;
Hb – гемоглобин, г/л;
1000 – коэффициент для пересчета концентрации глутатиона от молярной к миллимолярной;
F – отношение оптической плотности контрольной пробы до добавления ДТНБК (Е1 ) и после добавления (Е2 );
13600 – коэффициент молярной экстинции окрашенного катиона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК;
2.5. Определение активности глутатионпероксидазы
Принцип метода: глутатионпероксидаза катализирует реакцию взаимодействия GSH с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ). Активность фермента при этом может быть оценена по изменению содержания GSH в пробах до, и после инкубации с модельным субстратом в ходе цветной реакции с ДТНБК [Paglia, Valentine, 1967].
Ход определения
Отмытые и упакованные эритроциты гемолизировали охлаждённой до 0ºС водой в соотношении 1:200. 0,2 мл гемолизата смешивали с 0,73 мл сложного буфера и термостатировали 10 мин при 37°С. Реакцию инициировали внесением в реакционную смесь 0,07 мл 0,14%-ного раствора ГПТБ (коммерческий препарат). Строго по секундомеру через 5 мин инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 0,2 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольные пробы 0,14%-ный раствор ГПТБ вносили после осаждения белка ТХУ. Полученные пробы центрифугировали при 1700g в течение 10 мин. Супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона: к 0,1 мл супернатанта добавляли 2,65 мл 0,1 М трис-HCl буфера. После перемешивания пробы фотометрировали на СФ-26 при длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против дист. Н2О. Активность фермента в эритроцитах выражали в мкмолях GSH, окисленного за 1 минуту на грамм Hb, используя коэффициент молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК.
Реактивы:
1. Сложный буфер: 0,1М Трис-HCl-буфер, pH8,5, содержащий 6мМ ЭДТА и 12мМ азид натрия. Непосредственно на этом буфере готовят 4,8 мМ раствор GSH
2. 0,14%-ный раствор трет-бутил гидропероксида
3. 20%-ный раствор ТХУ
4. 0,1 М трис-HCl буфер, pH8,5
5. ДТНБК на абсолютном метаноле, 0,01М
Активность рассчитывают по формуле:
,
где:
А - активность фермента, мкмоль/мин×л;
∆С – разность концентраций GSH в опытной и контрольной пробах;
Vпр. – объем пробы, используемый для определения концентрации GPO
t – время инкубации;
Vр.с..- объем реакционной смеси;
201 – степень разведения эритроцитов в гемолизате;
1000 – коэффициент для пересчета активности GPO от молярной к миллимолярной;
Hb – гемоглобин г/л;
Активность GPO можно также выразить в мкмоль\мин на 1 г Hb
2.6. Определение активности глутатион-S-трансферазы
Принцип метода: активность глутатион-S-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между GSH и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ).
Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион -S- ХДНБ) [Habig et al., 1974].
Ход определения
Источником фермента служил осмотический гемолизат, который готовили добавлением к одному объему упакованных эритроцитов двадцати объемов дист. Н2О, охлажденной до 0°С. В кювету с длиной оптического пути 1,0 см, содержащую 2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН=6,5, добавляли 0,2 мл 0,015 М раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл гемолизата. Реакцию инициировали внесением в кювету 0,2 мл 0,015М ХДНБ (готовили на абсолютном метаноле). Параллельно опытной готовили контрольную пробу, в которую вместо гемолизата вносили дист. Н2О. Регистрацию оптической плотности проводили при t=25°C и длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания в течение трех минут. Активность фермента рассчитывали, используя коэффициент экстинкции для ГS-ХДНБ при длине волны 340 нм, равный 9,6 мМ-1*см-1, и выражали в ммолях образующихся глутатион S-конъюгатов в минуту на грамм Hb.
Реактивы:
1. 0.1М калий – фосфатный буфер РН6,5;
2. 0.015М раствор GSН;
3. 0.015М раствор ХДНБ.
Активность GPO рассчитывают по следующей формуле:
где:
А – активность фермента, моль\мин×Hb
∆E – изменение оптической плотности в мин.
d – толщена кюветы (1см)
f – коэффициент разведения эритроцитов в пробе
ε – коэффициент молярной экстинкции при χ=340нм (9600М-1×см-1)
Hb – гемоглобин г/л
1000 – коэффициент для пересчета активности GST от молярной к миллимолярной;
Vпр. – объем пробы, используемый для определения активности GST
Vр.с..- объем реакционной смеси;
2.7. Определение активности глутатионпероксидазы
Принцип метода: определение активности глутатионредуктазы основано на измерении скорости окисления NADPH, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм .
Для определения активности глутатионредуктазы использовали осмотический гемолизат, приготовленный следующим образом. К одному объему упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов добавляли девяти кратный объем холодной дистиллированной воды.
Ход определения:
В спектрофотометрическую кювету с расстоянием между рабочими гранями 10 мм последовательно вносят 2,7 мл калий-фосфатного буфера, 0,1 мл раствора NADPH, 0,1 мл гемолизата и 0,1 мл раствора GSSG. Реакция запускается добавлением в пробу окисленного глутатиона. Смесь перемешивают. Изменеие оптической плотности регистрируют через 1 минуту в течение 3 минут против пробы, содержащей все компоненты, кроме GSSG.
Реактивы:
1. 50 мМ калий-фосфатный буфер , рН 7,0, содержащий 1мМ EDTA;
2. 0,1 мМ раствор NADPH;
3, 0,5 мМ раствор окисленного глутатиона (хранят в замороженном виде).
Активность фермента выражают в мкмолях ¤г Hb в минуту. Расчет производят по формуле:
,
где:
А – активность глутатионредуктазы;
DЕ – изменение оптической плотности;
К – коэффициент, учитывающий разведение эритроцитов в реакционной пробе, равный 300;
6,22 – коэффициент экстинкции для NADPH в см-1/мМ-1, при длине волны 340 нм;
t – время наблюдения, мин;
d – расстояние между рабочими гранями кюветы (10 мм);
Hb – гемоглобин в г/л.
2.8. Статистическая обработка результатов
В работе использованы стандартные статистические приемы подсчета, медианы, определения 25 и 75 перцентеля с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Достоверность полученных данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, с достоверностью Р<0,05, корреляционный анализ по Спирману.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Анализ содержания GSH и активности глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с ЛОР-заболеваниями
Воздушные загрязнения играют ключевую роль в развитии окислительного стресса, который является причинной развития патологии дыхательной системы [Менщикова, 2008]. Особое положение, которое занимает эпителий легкого в отношении организма с насыщенной кислородом внешней средой, делает его объектом токсичного действия радикалов экзогенного и эндогенного происхождения. Острые респираторные заболевания являются главной причиной детской смертности: от пневмонии ежегодно в мире умирает более 4 млн. детей. В последние десятилетия наблюдается рост числа хронических неспецифических заболеваний легких, в настоящее время они занимают 3-е место среди причин смертности, в северных регионах на них приходится на 2/3 всех дней нетрудоспособности [Менщикова, 2008].
Проведенные исследования показали, что содержание восстановленного глутатиона у ЛОР-больных людей в 1,29 раза ниже, чем у практически здоровых людей. Активность GPO и GST в эритроцитах у ЛОР-больных людей снижается в 2,77 и 1,46 раз соответственно, по сравнению с активностью исследуемых показателей в эритроцитах практически здоровых людей. По активности GR достоверных отличий между исследуемыми группами не обнаружено. Полученные данные приведены в табл. 2.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
