Однократное или ежедневное введение эпиталамина в течение 5 суток в утренние часы 4-5-месячным самцам крыс приводит к существенному увеличению в эпифизе уровня серотонина, N-ацетилсеротонина и мелатонина в ночное время. У 18-20-месячных крыс аналогичное применение эпиталамина сопровождалось тенденцией к увеличению ночного подъема уровня мелатонина в эпифизе и в сыворотке крови животных. Как у молодых, так и у старых крыс эпиталамин не влиял на прямое О-метилирование серотонина в 5-метилтриптамин с последующим метаболизмом в 5-метил-оксииндолилуксусную кислоту (Anisimov et al., 1994). При электронно-микроскопическом исследовании эпифизов крыс, которым вводили эпиталамин, были выявлены признаки стимуляции активности пинеалоцитов. Интраназальное введение эпиталона крысам влияло на экспрессию гена c-fos в пинеалоцитах, которая зависит от уровня активации клеток. При интраназальном введении эпиталамина крысам, а также при внесении 10-7 М раствора эпиталамина в среду инкубации изолированного эпифиза крыс наблюдались изменения электрической активности пинеалоцитов (Khavinson, 2002).
О способности эпиталамина стимулировать функции эпифиза свидетельствуют результаты, полученные при изучении действия эпиталона на нейроэндокринную регуляцию у старых макак резусов (Khavinson et al., 2001). Эксперименты были выполнены на 6 молодых половозрелых (возраст 6-8 лет) и старых (20-26 лет) самках Масаса mulatta. Содержание мелатонина в крови у старых обезьян было достоверно ниже, чем у молодых, особенно вечером. У старых макак эпиталон в 3 раза повышал вечерний уровень мелатонина. У молодых обезьян этот эффект не наблюдался. Эпиталон не оказывал достоверного влияния на уровни ДГЕА, эстрадиола, прогестерона и тироксина. При введении старым макакам эпиталон восстанавливал циркадный ритм содержания кортизола в крови.
О действии эпиталона на эпифиз свидетельствует исследование, в котором показано, что внутрибрюшинное введение эпиталона у-облученным крысам сопровождается появлением ультраструктурных признаков усиления секреторной активности пинеалоцитов, нарушенной из-за облучения (Khavinson, 2002).
Предварительные данные, полученные И. Э. Бондаревым и соавт. (2003), говорят о том, что эпиталон в соматических клетках человека может индуцировать экспрессию энзиматического компонента теломеразы, теломеразную активность и элонгацию теломер. Возможно, что в этом может состоять механизм геропротекторного действия пептида.
Способность эпиталона оказывать одинаковое действие на организмы, далеко отстоящие друг от друга в филогенетическом отношении, может объясняться тем, что он действует на уровне транскрипционных факторов, которые относятся к числу наиболее консервативных в эволюционном отношении белков, и при этом на уровне отдельных трансфакторов (даже не их комбинаций) обнаруживается тканевая специфичность в пределах организма одного вида.
4.4 Влияние пептидных биорегуляторов на экспрессию генов.
В целом ряде экспериментов, описанных выше, были получены данные, свидетельствующие о том, что при действии пептидных препаратов, представляющих собой смеси природных пептидов или отдельные сконструированные пептиды, в тканях организма происходят изменения экспрессии генов. Выдвинута гипотеза, что эффекты пептидов обусловлены их действием на уровне регуляции экспрессии генов (Морозов, Хавинсон, 1996). Для того чтобы исследовать такую возможность более подробно, был проведен эксперимент с применением техники ДНК микрочипов. В использованной модификации этот метод позволяет одновременно определять изменения экспрессии 15 247 генов. С его помощью были исследованы уровни мРНК в сердце мышей до и после введения эпиталона или вилона (Анисимов С. В. и др., 2002).
В опытах использовано 30 самок мышей линии СВА, которые получали стандартный лабораторный корм и питьевую воду без ограничений. В возрасте 6 месяцев мыши были случайным образом распределены в 3 группы по 10 особей. Мыши подопытных групп в течение 5 дней получали подкожные инъекции 1 мкг вилона или эпиталона, растворенных в 0.1 мл 0.9%-ного раствора NaCl. Животные контрольной группы получали подкожные инъекции 0.1 мл 0.9 %-ного раствора NaCl. На 6-й день все мыши были умерщвлены декапитацией на гильотине, сердца были извлечены и немедленно заморожены в жидком азоте и далее хранились при -80°С до этапа выделения тотальной РНК. В эксперименте были использованы 15 247 клонов, входящих в библиотеку кДНК, принадлежащую Национальному институту старения США (NIA mouse 15K. cDNA clone set).
В ходе эксперимента была проведена трипликативная гибридизация микрочипов, содержащих 15 247 клонов кДНК, с образцами ткани сердца мышей контрольной и подопытных групп. Было выявлено 300 клонов (1.94 % от общего числа) с более чем двукратным изменением уровня экспрессии в сердцах мышей подопытных групп по сравнению с мышами контрольной группы. Под воздействием только вилона изменялась экспрессия 36 клонов, под воздействием только эпиталона - 98 клонов и под воздействием обоих пептидов - 144 клона. Всего же под воздействием вилона изменялась экспрессия 180 клонов и под воздействием эпиталона - 242 клонов. При введении вилона отмечено изменение экспресии 157 клонов в сторону увеличения и 23 клонов в сторону уменьшения. Максимальное увеличение уровня экспрессии под воздействием вилона по сравнению с контролем составило 6.13 раза, максимальное уменьшение -- 2.79 раза. Аналогично под воздействием эпиталона отмечено изменение экспрессии 194 клонов в сторону увеличения и 48 клонов в сторону уменьшения. Максимальное увеличение уровня экспрессии под воздействием эпиталона по сравнению с контролем составило 6.61 раза, максимальное уменьшение - 2.71 раза.
Следует отметить, что при введении вилона или эпиталона менялась экспрессия 5 из 13 генов, кодируемых митохондриальным геномом. Для 4 митохондриальных генов (16S - вилон и эпиталон; НАДН-дегидрогсназа 4 и 5 и цнтохром В - только эпиталон) уровень экспрессии повышался в 2.03-6.61 раза, в то время как для гена АТФазы 6-й уровень экспрессии под воздействием вилоиа снижался в 2.25 раза.
139 ядерных генов были разбиты по категориям согласно функциональной классификации генов сердечно-сосудистой системы. 44 гена не вошли ни в одну из категорий либо являлись генами гипотетических белков. Остальные 95 генов представили все 6 основных функциональных категорий генов, в том числе гены клеточного деления (14 генов), клеточных сигнальных систем и коммуникаций (15 генов), клеточной структуры и подвижности (7 генов), защитных систем клетки и организма (16 генов), экспрессии генов и белков (24 гена), метаболизма (19 генов).
Гены, уровень экспрессии которых изменялся под воздействием вилона и эпиталона, функционально относятся к самым разным клеточным системам. При сравнении их распределения по функциональным категориям отмечено его несовпадение с нормальным распределением для генов, представленных в сердце. Гены клеточного деления и защитных систем клетки и организма представлены среди генов с измененным уровнем экспрессии значительно шире, чем в общей совокупности (10.07% в сравнении с 5.68% для категории клеточного деления; 11.51% в сравнении с 6.71% для категории защитных систем клетки и организма). Таким образом, можно предположить, что относящиеся к этим двум подклассам гены являются наиболее значимыми эффекторами биологического действия вилона и эпиталона. Более детальный анализ функциональных подкатегорий показал, что наиболее значимыми являются изменения доли генов, имеющих отношение к регуляции клеточного цикла (подкатегория 1d: 5 генов - 3.6% против 1.59% в общей совокупности), мембранного транспорта/транспортных белков (подкатегория 4bЗ: 6 генов - 4.32 % против 0.9 %) и иммунной системы (подкатегория 4с: 5 генов - 3.6% против 1.75 %). При сравнении влияния вилона и эпиталона на гены, представленные в сердце, была обнаружена относительная избирательность воздействия эпиталонз на уровень экспрессии генов, имеющих отношение к рибосомальным белкам (подкатегория 5bЗ). Вилон увеличил экспрессию лишь одного гена данной подкатегории - киназы 1 рибосомальной РНК S6 (р70/р85 86-киназы), в то время как эпиталон, кроме 86-кинази. в 2.02-2.46 раза увеличил экспрессию генов рибосомальных белков L8, L27 и РНК S6 и S10 Существенно, что ген рибосомальной РНК S10 был представлен двумя клонами, имевшими сходство с нуклеотидными последовательностями гена крысы и человека и продемонстрировавшими почти одинаковое увеличение уровней экспрессии (в 2.02 и 2.09 раза соответственно).
Важным представляется влияние вилона и эпиталона на изменение уровня экспрессии нескольких генов, имеющих отношение к он-когенезу. Обнаружено уменьшение уровня экспрессии гена, сходного с онкогеном миелобластоза (вилон) и протоонкогена Bcl-3 (эпиталон). Пептиды увеличивают уровень экспрессии генов протеинкиназы C-zeta (эпиталон), LIM/PDZ-доменных белков Энигма (эпиталон), его гомолога 2 (оба пептида), которые, как полагают, также вовлечены в онкогенез и уменьшают экспрессию функционально связанного с последними гена PDZ-доменного белка Cipp (вилон).
Также обращает на себя внимание влияние пептидов на большое число генов, имеющих отношение к обмену кальция, в частности на ген куллина-5, гены Ксnn4 и Dcamkll (экспрессия увеличивается обоими пептидами), кальмодулин (экспрессия увеличивается эпиталоном), и гены Са-связывающего белка кальбайндина и Ксnn2 (экспрессия уменьшается эпиталоном). Кроме того, в той же функциональной категории (клеточные сигнальные системы и коммуникации) обнаруживаются гены трех серин/треониновых киназ (Pctk3, FUSED, Stkl)), экспрессия которых увеличивается под воздействием обоих пептидов. По крайней мере одна из этих киназ (Stkl 1), функция которой неясна, обладает антиканцерогенными свойствами, и мутации ее гена приводят к развитию синдрома Пейтца-Егерса, сопровождающегося высоким риском развития опухолей многих локализаций, эти данные согласуются с нашими наблюдениями об угнетающем влиянии эпиталона и вилона на развитие спонтанных опухолей.
Таким образом, установлена возможность специфического влияния пептидных биорегуляторов эпиталона и вилона на экспрессию генов. Вместе с тем ясно, что в опытах в условиях целостного организма in vivo практически невозможно определить, является ли действие исследуемого фактора на данный орган прямым, или оно опосредовано прямым действием на какие-то другие органы и влиянием уже с их стороны на исследуемый орган. В частности, выше приводились факты, свидетельствующие о влиянии эпиталона и вилона на нейроэндокринную и иммунную системы, поэтому нельзя исключить возможность того, что продемонстрированные изменения экспрессии генов в сердце вызваны изменениями гормонального фона, состояния ДНЭС или секреции лимфокинов. В этой связи важно, что было показано прямое влияние вилона на экспрессию гена интерлейкина-2 в лимфоцитах (Khavinson, 2002).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50
