37. Оптимальная концентрация фосфата для таких экспериментов подбирается индивидуально для разных задач и видов клеток. "Переносить" данные по оптимальной концентрации с одного вида экспериментов (или клеток) на другой надо осторожно.
Основными соединениями фосфора-32, применяемыми в life science, являются нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные в альфа или гамма положении. В конце 60-х — начале 80-х годов ХХ века было разработано несколько способов синтеза этих соединений, но после работы Джонсона и Валсеса, предложенный ими ферментативный способ стал рутиной как для лабораторного синтеза, так и для масштабного производства. Химические методы синтеза меченных фосфором-32 соединений используются, когда нет ферментативного пути, например для синтеза синтетических аналогов нуклеотидов.
Измерение активности радионуклидов 32Р и 33Р — операция достаточно простая — любой жидкостной сцинтилляционный β-счетчик считает 32Р и 33Р с эффективностью не ниже 90%. Для фосфора-32 использование сцинтиллятора совсем не обязательно. Обычно измерение фосфора-32 проводят за счет "свечения Черенкова" — эффекта, обусловленного взаимодействием высокоэнергетических электронов с окружающей средой. Не вдаваясь в физические аспекты Черенковского свечения, следует знать, что сцинтилляционные счетчики "считают" фосфор-32 без всякого сцинтиллятора с эффективностью около 30%. Черенковское свечение фосфора-32 можно легко увидеть. Нанесите на подложку (пластинку ТСХ или фильтровальную бумагу) 1 мкл раствора 32Р-ортофосфорной кислоты (или любого другого соединения фосфора-32) с активностью 50 мкКи (около 2МБк) и поместите подложку между плоскостями двух кусков обычного стекла, толщиной 4÷5 мм. В темноте (только без "красного" света) через 3÷5 мин. адаптации глаза будет хорошо видно зеленовато-голубое свечение пятна, соответствующего точке нанесения раствора на подложку. Не подносите такой источник близко к глазам — все прекрасно видно с расстояния 40÷60 см.
Весьма полезным для работы является возможность измерения фосфора-32 прямо в пластиковых пробирках, помещенных в стандартный сцинтилляционный флакон. На практике это означает, что вы можете измерять активность своего образца, например, вырезанный кусок из агарозного геля или пробирку с фракцией элюата хроматографического разделения, а затем использовать образец для дальнейшей работы. Такая особенность фосфора-32 является его важнейшим преимуществом перед другими β-радионуклидами, применяемыми в life science. Все остальные β-радионуклиды, приведенные выше в таблице 1, включая фосфор-33, требуют для измерения в сцинтилляционном счетчике прямого контакта с сцинтилляционной жидкостью, т.е. добавления образца прямо во флакон, содержащий сцинтиллятор. Естественно, после этого образец для дальнейшей работы теряется.
Среди радионуклидов, применяемых в life science, фосфор-32 является "рекордсменом" по чувствительности методик с его использованием. Однако, простой расчет чувствительности метода (поделите обычный предел обнаружения фосфора-32, т.е. около 3÷4 Бк, на максимальную молярную активность используемого соединения, т.е. около 2х1017 Бк/моль) показывает величину около 10-17 моля. К сожалению, это неправильно. Причина этого в высоком "биологическом" фоне. Например, при постановке ДНК-полимеразной реакции контрольная проба, в которую добавляют все компоненты реакции кроме фермента, также показывает некоторое "включение" радиоактивного фосфора в ДНК, на самом деле обусловленное просто неспецифической сорбцией радиоактивного предшественника биосинтеза. Такая неспецифическая сорбция есть всегда в любом биохимическом эксперименте и фактически чувствительность метода будет определяться величиной этого "биологического" фона. Например, в реакцию добавлено 0,1 МБк [α-32P] dNТР (это примерно 2х106 срм по Черенкову), ферментативое включение в ДНК около 30%, а неспецифическая сорбция — фон — составляет около 0,1%, т.е. 2х103 срм. Граница достоверности определяемой величины будет определяться именно неспецифической сорбцией (в этом примере 2х103 срм), которая обычно гораздо выше фона измерительной аппаратуры. В этом примере фон 2000 срм, и, следовательно, достоверная величина измеряемого эффекта должна быть не ниже 6000 срм, что в 30 раз снижает чувствительность по сравнению с "идеальной" расчетной.
Использование фофора-32, а позднее и фосфора-33, начиналось еще в 50-х годах ХХ века, однако после разработки методов секвенирования ДНК с помощью фосфора-32 спрос на соединения, меченные фосфором-32, достиг просто огромных величин. В "пике" потребления нуклеотиды, меченные фосфором-32, производились в мире в объеме несколько десятков кюри ежемесячно (это десятки тысяч фасовок каждый месяц), и только флюоресцентные методы секвенирования спустили потребление радиоактивного фосфора с заоблачных высот к нынешнему состоянию.
Традиционно меченые фосфором нуклеотиды используются по нескольким направлениям:
38. Введение в ДНК (РНК) за счет нуклеозид-5' — [α-32Р]-трифосфатов и изучение соответствующих ферментов.
39. Введение в олигонуклеотиды 32Р фосфорилированием 5'-конца с помощью [γ-32P] ATP и полинуклеотидкиназы.
40. Фосфорилирование белков протеинкиназами с помощью [γ-32P] ATP.
Наиболее востребованным меченым соединением фосфора-32 является аденозин-5'-[γ-32P] трифосфат, который обычно сокращенно обозначают [γ-32P] АТР. Это вполне объяснимо, т.к. кроме широко известной методики введения 32Р-метки на 5'-конец олигонуклеотида с помощью Т4 полинуклеотидкиназы, [γ-32P] АТР используют для изучения различных фосфотрансфераз (киназ), в том числе и для биоскрининга химических библиотек протеин-киназными тестами. Нуклеозид-5'трифосфаты, меченные фосфором-32 в α-положении, сокращенно обозначают [α-32Р] NТР или [α-32Р] dNТР (рибо- или 2'-дезоксирибонуклеотиды соответственно) и используют, в основном, для введения "метки" в нуклеиновые кислоты с помощью РНК- или ДНК-полимераз. Естественно, сюда же примыкают исследования биосинтеза нуклеиновых кислот и их ферментативного аппарата. Технология введения 32Р-метки в нуклеиновые кислоты подробно изложена в "классике методов" ( Маниатис Т. Фрич Э. Самбрук Дж. "Молекулярное клонирование" М. "Мир" 1984 г.). Поэтому я отмечу только некоторые характерные для начинающих ошибки.
Вполне естественное стремление каждого исследователя получить меченый препарат ДНК (например ДНК-зонд для гибридизации) с максимальной удельной активностью имеет свои ограничения. Считается, что препарат ДНК, имеющий удельную активность не менее 108 срм на мкг ДНК, "пометился" хорошо и может дать при гибридизации чувствительность, близкую к максимальной. Если удельная активность препарата 107÷108 срм на мкг ДНК, то результат получится весьма посредственный, а если синтезированный вами препарат имеет удельную 106 срм на мкг ДНК, то вы что-то сделали неправильно — такой препарат к работе мало пригоден.
Еще одна характерная ошибка начинающих исследователей — попытка синтеза высокомеченного ДНК-зонда с помощью замены нерадиоактивных dNTP на [α-32Р] dNТР. К сожалению, попытки использовать для синтеза меченой ДНК 2÷3, а иногда и всех 4-х меченых [α-32Р] dNТР вместо одного, заранее обречены. В лучшем случае использование двух меченых [α-32Р] dNТР даст почти такой же результат (как правило, все-таки немного ниже) как использование одного [α-32Р] dNТР. В остальных вариантах, независимо от конкретных нуклеотидов, удельная активность такой 32Р-ДНК будет существенно ниже. Это обусловлено двумя причинами. Во-первых, оптимальная концентрация dNTP для синтеза меченой ДНК не ниже 10 мкМ (часто делают ещё выше), а молярная концентрация меченого [α-32Р] dNТР в реакции — примерно 0,2÷0,4 мкМ. Замена "холодного" dNTP на [α-32Р] dNТР снижает концентрацию в 20÷40 раз. Следовательно, замена всех dNTP на радиоактивные [α-32Р] dNТР снижает концентрацию всех предшественников биосинтеза до величин ниже Км (константы Михаэлиса) для каждого dNТР, что в данном случае почти останавливает реакцию. Во-вторых, химическая чистота "холодных" dNTP, как правило, выше [α-32Р] dNТР и, соответственно, количество примесей, способных ингибировать ДНК-полимеразу, возрастает, если заменять все dNTP на соответствующие [α-32Р] dNТР.
Аналогичная ситуация наблюдается и при использовании [α-32Р] NТР в синтезе РНК. Так как величина Км большинства РНК-полимераз находится в интервале 10÷100 мкМ, то использовать [α-32Р] NТР без добавления в реакцию "холодного" трифосфата до приемлемой концентрации бессмысленно — реакция не идет. Более того, РНК-полимеразы более "капризны", чем ДНК-полимеразы, и требования к химической чистоте всех ингредиентов, в том числе и меченых предшественников биосинтеза РНК, еще более жесткие.
Все фирмы-производители нуклеозид-5'трифосфатов, меченых фосфором-32 (или 33), поставляют эти соединения с добавками, снижающими химическую деструкцию веществ, обусловленную воздействием ионизирующего излучения, и в криостатах с сухим льдом (при -70°С). Такие добавки, "продлевающие" жизнь меченым соединениям, получили название радиопротекторов — по аналогии с веществами, снижающими вредное воздействие ионизирующего излучения на живые организмы. Каждый производитель использует свои, как правило, запатентованные радиопротекторы, продлевающие сроки использования меченых препаратов. Часто такие радиопротекторы (или их комбинации) окрашены в яркие цвета, что создает определенное удобство для работы — хорошо видно даже минимальный объем окрашенного меченого соединения. Естественно, что важнейшее требование к радиопротектору для меченых соединений в life science — это нетоксичность или "безвредность" самого радиопротектора и продуктов его радиолиза для тех биологических и ферментативных систем, в которых используется данный меченый препарат. Иными словами, радиопротектор не должен участвовать в биологическом процессе, который вы собираетесь изучать с помощью меченого соединения, содержащего радиопротектор. Соединения, меченные фосфором-32 или фосфором-33, которые производили и производят в России, окрашены за счет радиопротектора в ярко-красный цвет. При длительном хранении цвет будет "желтеть". Пожелтевший препарат лучше выбросить сразу — весь радиопротектор в таком препарате уже разрушился, и ничего хорошего от его радиоактивных остатков ждать не следует.
